【摘 要】
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目的:利用分子克隆的方法构建人源PD-L2(以下简称hPD-L2)两种片段pET-27b-hPD-L220-208和pET-27b-hPD-L220-123,转化至表达宿主菌后,IPTG诱导表达hPD-L2蛋白,纯化复性后作为
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目的:利用分子克隆的方法构建人源PD-L2(以下简称hPD-L2)两种片段pET-27b-hPD-L220-208和pET-27b-hPD-L220-123,转化至表达宿主菌后,IPTG诱导表达hPD-L2蛋白,纯化复性后作为免疫原免疫Balb/c小鼠,比较两者之间的免疫效果,制备hPD-L2单克隆抗体,为制备具有一定应用价值及病理诊断价值的hPD-L2单克隆抗体奠定基础。方法:通过NCBI查找hPD-L2全长基因,送商业公司合成,利用PCR克隆hPD-L2的胞外区和胞外IgV domain区,构建pET-27b-hPD-L2重组质粒。将其转化至大肠杆菌Rosseta,经终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达后,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)验证,利用Ni-NTA柱亲和纯化包涵体蛋白,复性后再次利用AKTA纯化系统的分子筛凝胶过滤G75柱进行分离纯化。将纯化后的蛋白免疫Balb/c雌性小鼠。免疫小鼠三次后取血,利用间接ELISA法测定血清的滴度,滴度达到106的小鼠血清再进行免疫组化评价,利用杂交瘤技术制备hPD-L2单抗,间接ELISA,免疫组化法筛选检测,得到的抗体进行亚型鉴定和纯化,纯化后蛋白电泳检测纯化效果。通过免疫组化(IHC)和Western-blot评价单抗的效果。成果:1、成功构建胞外区重组质粒pET-27b-hPD-L220-208和Igv domain pET-27-hPD-L220-123,以终浓度0.5mMIPTG,37℃诱导菌株获得大量表达的蛋白,hPD-L2理论分子量约为22 kDa和12 kDa。2、免疫血清效价均达到106;免疫组化(IHC)结果显示胞外区重组蛋白hPD-L220-208的膜定位较清晰、准确,而单独的IgVDomain区的重组蛋白hPD-L220-123阳性较弱,膜定位模糊。3、成功制备hPD-L2(20-208)杂交瘤细胞,最终获得一株单克隆细胞株10E10,纯化后的抗体亚型鉴定为IgG3,轻链为κ型,IHC结果显示具有较好的hPD-L2膜定位,背景较清晰和非特异性染色较少,也可应用于Western-blot检-测。结论:构建pET-27b-hPD-L220-208的基因片段可成功制备特异性强、亲和力高的hPD-L2单克隆抗体,应用在免疫组化(IHC)具有较好的效果。
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