论文部分内容阅读
背景与目的建立C57BL/6小鼠乙型肝炎病毒HBV感染的动物模型,参考基因芯片结果,检测模型肝组织中趋化因子IL-18、Mig、IP-10、CXCL12、CCR7、CCL19及部分急性期蛋白基因、免疫相关蛋白的基因表达差异,为进一步研究炎性因子在HBV感染中作用及其机制奠定基础。实验方法1.建立C57BL/6小鼠HBV感染的动物模型:pBluescript-HBV质粒转化超级感受态细菌DH5α,提取大量质粒,高压水动力法于小鼠尾静脉注射,建立感染模型,同时设立空载对照组(pBluescript)动物模型。2.建模第4天取模型动物外周血,ELISA试剂盒检测外周血中HBsAg的表达水平,验证感染模型是否成功建立,收取肝组织冻存。3.参考基因芯片检测结果,挑选感兴趣的差异表达趋化因子,设计引物。Trizol法提取肝组织总RNA,逆转录为cDNA,Real-time PCR检测实验组和对照组对应因子的基因拷贝数量,RT-PCR凝胶电泳分析。4.免疫组织化学法对表达差异较明显的因子IP-10进行检测。结果1.HBV感染C57BL/6小鼠模型的建立:ELISA检测尾静脉高压注射HBV C57BL/6小鼠组HBsAg结果为阳性,表明通过尾静脉高压注射HBV感染C57BL/6小鼠模型建立成功。2.HBV感染C57BL/6小鼠模型肝组织趋化因子的表达:①Real-time PCR检测结果表明,扩增曲线和溶解曲线良好,实验组与空载对照组相比,IL-18,Mig,IP-10,Cxcl12,Ccl19,Ccr7的表达均有不同程度的增高,以IP-10最为显著;RT-PCR扩增产物凝胶电泳可见特异引物扩增的条带,IP-10相应条带最为明显,结果表明实验组中上述趋化因子基因拷贝数有不同程度增加,与Real-time PCR检测结果呈一致趋势;②免疫组织化学方法检测结果表明,实验组IP-10表达增加。3.HBV感染C57BL/6小鼠模型肝组织免疫应答分子和急性蛋白分子的表达:Real-time PCR结果表明,扩增曲线和溶解曲线良好,与对照组相比,实验组中急性期应答相关分子Saa2表达增高;RT-PCR扩增产物电泳图与对照组比较,实验组中热休克蛋白相关基因Dnajc10、急性期应答相关因子Saa2、固有免疫应答分子Masp1、以及抗凋亡因子Vnn1的表达均有不同程度增加。结论依据ELISA检测HBsAg结果表明,HBV感染C57BL/6小鼠动物模型建立成功。Real-time PCR和RT-PCR均显示趋化因子IL-18、Mig、IP-10、Cxcl12、Ccl19、Ccr7在实验组有不同程度的增高;PCR结果与免疫组织化学检测结果均表明IP-10因子表达增加明显,提示HBV感染中趋化因子的表达不同程度增加,以及免疫应答相关分子的表达均有不同程度的表达增加,其表达增高作用及其机制尚待进一步研究。