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目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD),是临床最常见的痴呆类型,发病逐年增多,鉴于目前AD的病因和发病机制尚不明确,故至今没有彻底治愈的方法。近年越来越多的研究表明线粒体异常在AD致病中起重要作用,其中线粒体动力学在AD发病机制中的改变,已成为目前研究的热点。而关于AD发病不同阶段,线粒体动力学的动态改变情况,目前研究尚不多见,还需要我们进一步深入研究。本研究动态观察了实验组3、6、9、12月龄的AD小鼠和对照组同月龄C57小鼠的水迷宫行为学改变、电镜下脑组织线粒体形态的变化、线粒体动力学相关分裂和融合蛋白的表达情况等,从而探讨线粒体动力学参与AD发病不同阶段的具体改变情况,有助于通过调节线粒体动力学为AD的病因治疗,提供新的治疗靶点和治疗思路。方法:1.动物和组织:实验组为3月龄、6月龄、9月龄和12月龄的阿尔茨海默病模型APPsw/PSldE9双转基因小鼠,该小鼠是以C57BL/6小鼠为遗传背景。对照组为同月龄的C57BL/6小鼠(每组15只,均为雄性)。应用10%水合氯醛麻醉小鼠后,颈椎离断法处死小鼠,3分钟内快速取脑组织,一侧大脑半球用于电镜,另一侧大脑半球用于免疫印迹试验。2.行为学检测:采用Morris水迷宫实验评估小鼠的学习和空间记忆能力。检测过程包括实验适应期(第1天,没有平台),学习实验(第2-6天,寻找隐匿平台)和空间探索实验(第7天,没有平台)。每组15只小鼠。在学习实验中,小鼠寻找并爬上平台的时间记录为潜伏期,以潜伏期来评定小鼠的学习能力。小鼠寻找平台的最长时间为60s,如果超出60s,小鼠仍没有找到平台,则将小鼠引到平台上,其潜伏期记为60s。平台放在水池的SW(southwest)象限,隐藏在水面下0.5-1cm,每只小鼠每天训练4次,入水点分别为N(north)、SE(southeast)、E(east)、NW(northwest),次序随机,每次时间共 60s。空间探索实验:取出平台,将小鼠从水迷宫NE(northeast)方向投入水中,共记录60s,统计小鼠在原平台所在象限游泳的总时间;统计小鼠穿越原平台所在位置的次数,以此作为评定小鼠的记忆能力的指标。3.为了明确随着月龄的增加,APPsw/PS1dE9双转基因小鼠和C57小鼠海马组织中线粒体的改变,我们采用透射电子显微镜观察小鼠海马CA1的超微结构。每组随机选取15-20张电镜图片,选取15个神经元胞体中的线粒体进行观察,统计分析线粒体的总数、异常线粒体的数目、线粒体的形态、长度和分布。线粒体长度采用Image J软件测量。4.为了明确线粒体动力学相关的蛋白是否随着AD的进展而不同,我们采用免疫印迹的实验方法测定各组小鼠脑组织中线粒体DRP1、FIS1、MFN2和OPA1的含量,以确定AD动物中线粒体动力学的变化。结果:1. APP/PS1双转基因小鼠行为学改变明显的是9和12月龄组。空间学习实验,历时5天的训练,每组小鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短。APP/PS1双转基因小鼠的逃避潜伏期长于对照组,3月龄和6月龄的APP/PS1双转基因小鼠与对照组相比未发现统计学差异,直到9月龄和12月龄APP/PS1双转基因小鼠的逃避潜伏期与同月龄C57小鼠相比才具有显著不同。在空间探索实验中,各月龄的APP/PS1双转基因小鼠目标象限所在时间、穿越平台次数均比对照组C57小鼠减少,这提示整体差异。然而,只有12月龄APP/PS1双转基因小鼠的记忆能力出现明显下降。因此,9月龄和12月龄的APP/PS1双转基因小鼠出现明显学习能力及空间记忆能力改变。2. APP/PS1双转基因小鼠海马组织中线粒体形态学改变始于3月龄,早于认知功能障碍的发病时间。相比较同月龄的C57小鼠,3月龄APP/PS1小鼠海马CA1区可见核周线粒体聚集,线粒体数目增多,源于线粒体分裂环形成增多,并可见细长的线粒体。6月龄APP/PS1小鼠却少见线粒体分裂环形成,线粒体体积更大,可见许多破碎的线粒体,表现为膜结构不连续,嵴不清晰。9月龄APP/PS1小鼠海马内线粒体分裂环形成显著增多,可见许多损伤、退化和片段化的线粒体。12月龄APP/PS1小鼠海马脑内可见大量退变的、片段化的线粒体在神经网络中聚集,形成髓样小体,可能是晚期AD的电镜下特征性的改变。而在同月龄C57小鼠中很少观察到以上线粒体的形态改变。3.免疫印迹实验结果显示,3月龄AD小鼠脑组织线粒体分裂蛋白(DRP1、FIS1)和融合蛋白(MFN2、OPA1)表达含量与对照组相比显著增加,提示线粒体动力学异常可能是诊断AD早期的标志物。相反,6月龄APP/PS1双转基因小鼠海马组织中线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1和线粒体内膜融合蛋白OPA1表达减少,线粒体外膜融合蛋白MFN2表达增加。与同月龄C57小鼠相比,9月龄和12月龄APP/PS1双转基因小鼠的线粒体分裂蛋白(DRP1、FIS1)和融合蛋白(MFN2、OPA1)表达显著增加(9月龄FIS1除外)。以上数据表明,APP/PS1双转基因小鼠和C57小鼠海马组织中线粒体分裂蛋白和融合蛋白的含量与基因型和月龄相关,提示AD发病的不同阶段,线粒体动力学相关蛋白表达不同。结论:我们的研究表明线粒体形态学和线粒体动力学在AD动物模型中是年龄相关的,提示在AD疾病进程的不同阶段,可通过调节异常的线粒体动力学开发新型治疗措施。更重要的是,我们发现APP/PS1双转基因小鼠进行性记忆力下降出现的时间要晚于线粒体功能异常,因此,异常的线粒体动力学可能是AD病程的早期事件。以上结果可为研究AD的发病机制提供新的视野,也可用于早期发现和诊断AD、监测AD疾病的进展提供帮助。