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微孢子虫（Microsporidia）作为一类单细胞的专性寄生真菌,广泛存在于自然界中,具有广阔的宿主域,能够感染脊椎动物和无脊椎动物。家蚕微粒子（Nosema bombycis）作为第一种被人类所熟知的微孢子虫,引起家蚕微粒子病（Pébrine）是蚕丝产业的毁灭性病害,严重威胁蚕丝业的可持续发展。因此,迫切需要创制家蚕微粒子病抗性素材,培育抗性品种,为家蚕微粒子病的绿色防控提供重要保障。当前家蚕微粒子病防控还是沿用巴斯德博士提出的母蛾镜检法对蚕种进行检疫,控制病原垂直传播;用严格的环境消毒、桑叶消毒等措施控制病原水平传播。这些防控措施不仅费时费力,劳动强度大,而且大量漂白粉等消毒药剂的使用,环境污染严重,严重制约了蚕丝产业的可持续发展,迫切需要家蚕微粒子病抗性品种。目前家蚕资源中未发现家蚕微粒子病的抗性素材,创制家蚕微粒子病抗性素材尤为迫切。由于家蚕微粒子特异性诱导型启动子是创制家蚕微粒子病抗性素材的必要条件,而目前又未筛选到该类启动子。根据家蚕微粒子的生活史特征,家蚕微粒子的分泌蛋白可作为构建家蚕微粒子诱导型启动子的核心元件。因此,基于分泌型蛋白构建一套家蚕微粒子诱导型基因编辑系统对于微孢子虫的防控体系的建立及相关功能基因研究具有积极意义。鉴于此,本研究通过相关数据库预测并分析了家蚕微粒子的分泌蛋白,并筛选到了家蚕微粒子分泌蛋白NBO29g0041（下文均简称为NB29）,构建了基于微孢子虫分泌蛋白的家蚕微粒子诱导型基因编辑系统,得到了以下研究结果:1.家蚕微粒子分泌蛋白相关基因的筛选通过对微孢子虫数据库（Microsporidia DB）中家蚕微粒子基因分析,筛选具有信号肽且不具有跨膜结构域的分泌蛋白,得到了399个家蚕微粒子基因。通过对这些基因进一步生物信息学分析,筛选得到了家蚕微粒子NB29基因。NB29基因全长459 bp,编码的蛋白含152个氨基酸残基。经相关在线预测软件分析表明,NB29基因的信号肽序列位于第123位氨基酸,该基因还含有两个核定位信号（NLS）,分别位于第6579位氨基酸和98114位氨基酸。预测该蛋白可以定位于宿主细胞核中,满足分泌蛋白的相关条件,初步作为研究的靶基因。2.家蚕微粒子NB29蛋白的特征鉴定首先利用限制性核酸内切酶EcoR I和Xho I酶切酵母信号肽诱捕载体pSUC2T7M13ORI,将克隆NB29长度为69bp的信号肽序列连接于其上。将带有NB29信号肽的载体转化到酵母YTK12菌株中,不同于pSUC2-Mg87,NB29实验组与阳性对照结果一致:其信号肽可发挥功能并分泌载体中的蔗糖酶蛋白,从而使得缺陷型酵母可在YPRAA培养基中正常生长。TTC显色反应表明NB29的信号肽序列转化酵母菌后可以分泌蔗糖酶,表明NB29信号肽序列可发挥功能,是分泌型蛋白。亚细胞定位鉴定发现,当NB29去掉信号肽（NB29-B）时在BmN-SWU1细胞核质都有分布,且具有明显的点状聚集现象,可能存在自身相互作用。通过免疫共沉淀（Co-IP）和双分子荧光互补试验（BiFC）证明NB29-B存在自身相互作用,为构建诱导型Cas9基因编辑系统奠定了基础。3.基于家蚕微粒子NB29蛋白的Cas9系统构建对NB29蛋白信号肽及两个核定位信号依次进行截短突变,分析其在BmN-SWU1细胞中的定位情况。发现当只对核定位信号进行截短突变时,相应的截短突变体均定位于细胞质中。将对核定位信号截短的突变体分别与缺失信号肽的截短突变体（NB29-B）共转于BmN-SWU1细胞,发现对两个核定位信号均缺失的截短突变体（NB29-N3）入核趋势最为明显。MTS实验证明细胞过表达NB29-N3对家蚕微粒子增殖无明显影响。通过免疫共沉淀（Co-IP）验证了NB29-B与NB29-N3存在相互作用。初步将NB29-N3作为最优截短突变体。将2个NB29-N3蛋白串联于Cas9蛋白的C端,融合蛋白可在细胞质中正常表达。为模拟病原感染情况,同时转染NB29-B,随着转染时间的延长,可以明显观察到Cas9蛋白入核比例逐渐增加。且在过表达NB29-B后,可以检测到egfp的敲除。上述研究表明诱导型编辑系统构建成功,在细胞过表达水平可发挥诱导编辑效果。4.家蚕微粒子诱导型Cas9系统的初步应用BmN-SWU1细胞中过表达NB29-B后银染、LC-MS/MS分析筛选得到与NB29-B互作的宿主基因BmRpn3。通过免疫荧光及免疫共沉淀验证NB29-B蛋白与BmRpn3蛋白相互作用。为了提高编辑效率,将Cas9融合蛋白与相应sgRNA串联于同一载体,病原感染宿主细胞后,利用本文构建的病原诱导型基因编辑系统可以对宿主基因BmRpn3进行编辑,且敲除BmRpn3基因可以抑制家蚕微粒子的增殖,这表明所构系统可以达到病原诱导编辑的效果。综上所述,本研究发现家蚕微粒子NB29蛋白为分泌蛋白,能进入宿主细胞核,并且其截短突变体NB29-N3可以定位于细胞质中。把NB29-N3融合Cas9蛋白在细胞质中稳定表达。在病原感染细胞后,分泌的NB29-B因与NB29-N3相互作用把NB29-N3与Cas9的融合蛋白拖入宿主细胞核中,达到诱导编辑的目的。同时寻找到与NB29-B相互作用的家蚕BmRpn3蛋白,利用该系统诱导编辑BmRpn3基因可以抑制病原的增殖。本研究构建了一种基于家蚕微粒子分泌蛋白的诱导型基因编辑系统,有助于进一步完善当前微粒子病防控体系,同时也为相关病原防控提供了新的研究思路。