创面产品往往因其具有显著抗菌及促进创面愈合的效果而受到患者青睐,其中银由于独特的广谱抗菌特性且较少产生耐药性等成为护创产品的常用材料之一。从国内外含银产品应用于临床各类创面后的效果来看,含银产品在创面愈合过程中发挥了积极作用,主要体现在其较快的促进愈合速度、较好的生物相容性、显著的抗菌作用等方面的优势。随着纳米技术的出现,银被赋予了更优异的性能,这使纳米银相关产品超越传统银离子产品进入人们生活。然而不久后就发现纳米银的潜在毒性,故我国国家食品药品监督管理局(CFDA)将纳米银生物材料类医疗器械明确为第三类(最高级别、严格控制)医疗器械管理,对医疗器械注册、审批、监管也更加严格,很多名称含有纳米银或单质银的产品纷纷下架,银离子产品顺势增多。因此广泛接触银离子产品对人体造成的影响也受到关注,相关部门建立一个安全合理的产品含量范围及质量评价体系的需求迫在眉睫。由于含银产品大多作为医疗器械(而非药物)来管理,在含量、性状等方面没有具体且明确的要求,产品质量参差不齐,加之其往往采取比较直接的方式应用于人体创面,其剂量是否如厂家描述及评价其安全性和促愈效果显得尤为重要。对此本课题对市售常见含银产品质量及毒性效应进行评价,以期为市场监管提供技术参考。在开展实验研究前,通过阅读文献了解了银离子产品在创面治疗中的相关应用和治疗效果,在梳理国内含银医用产品临床反馈资料时发现,含银产品往往采取比较直接的方式应用于人体,常见形式为液体、凝胶、敷料等。根据临床科室使用情况及产品市场情况,选取并购买了常用且常见的5种含银医用产品作为研究对象,分别标记为产品A(液体)、B(液体)、C(凝胶)、D(凝胶)和E(敷料)。本研究首先考察了各产品基本性状及银含量,并对其中的敷料类产品E的银分布均匀性及释放特性进行了研究。在效应研究方面以小鼠成纤维细胞(L929)和人永生化表皮细胞(HaCat)作为体外评价模型,用MTT实验和LDH实验评价各产品的细胞毒性效应。进一步选取临床使用最广泛的产品A进行动物实验,并与同类型国外含银创面产品S比较,通过观察小鼠的皮肤刺激情况、创面愈合情况、含银量及皮肤病理学等指标,评价产品的抗感染促修复效果。为了减轻银离子造成的细胞损伤,金属硫蛋白(Metallothionein,简称MT)在金属解毒方面的效果引起了我们的注意。金属硫蛋白是一种分子量低、富含半胱氨酸的胞内蛋白质,且具有重金属解毒能力。本实验在发现高剂量银离子产品对细胞的损害后联想到MT的解毒机制,初步探索了MT对银离子产品造成的细胞氧化应激损伤的缓解作用。得出的主要结论如下:1.各产品银含量检测:除D产品标明为单质银产品外,A、B、C产品均为银离子产品。A、B、C、D各产品银含量依次为(256.42±4.29)μg/mL、(270.86±3.33μg/Ml)、(650.88±3.50)μg/g、(430.14±3.03)μg/g,均与标示浓度吻合。单片E敷料产品各部位银含量为(209.51±1.77)μg/g,含量偏差为13.61%,相对较均匀;各敷料银含量为(208.20±1.05)μg/g,各敷料银含量分布偏差为7.42%,相对较均衡。结果表明各产品在银含量方面均符合自己的产品标示标准,但各产品间的含量差异较大。2.体外释放度研究:采用直接释放法,在10 min后,A、B、C和D产品平均释放率分别为(83.17±5.86)%、(89.34±5.26)%、(91.06±6.78)%、(58.36±5.96)%;30 min后各产品释放率依次为(90.91±5.76)%、(93.79±5.13)%、(92.59±6.78)%、(85.97±6.92)%,在1 h后各产品释放率分别为(95.43±6.97)%、(95.20±5.61)%、(94.70±5.84)%、(93.32±7.31)%。四种产品在1 h后的释放量均达到其标示含量的90%以上,其中A、B、C三种产品在30 min后的释放量就已经达到90%以上。表明本实验所选含银产品均没有缓释功能,临床应用中创面细胞接触的银离子含量接近其本身的含量。3.体外细胞毒性评价:各产品染毒HaCat细胞MTT实验显示,与空白对照比较,稀释100倍的A产品和B产品及稀释100、200倍的C产品染毒后的细胞存活率均显著降低(P<0.01)。各样品对L929细胞的MTT实验结果显示,与空白对照相比,稀释100、200倍的C产品染毒细胞后细胞存活率均显著降低(P<0.01),其他稀释液处理下细胞存活率无明显下降(P>0.05)。与阳性对照相比,稀释400、800倍的C产品与各稀释倍数下的A、B、D产品染毒后的细胞存活率均有统计学差异(P<0.01)。MTT结果显示,含银产品可引起细胞活力变化,且在相同暴露条件下,HaCat细胞对含银产品的毒性表现比L929细胞更敏感。细胞形态学观察显示,除去单体银产品D外,其余银离子产品表现为:A、B产品在稀释100倍下对于HaCat细胞、C产品在稀释100和200倍下对于两种细胞染毒24小时后均可以引起明显细胞形态学改变,出现细胞间距增加、细胞缩小变圆、漂浮细胞增加等现象。LDH实验结果表明,一定浓度的含银产品会对HaCat和L929细胞细胞膜造成不同程度的破坏。研究发现含银产品可以造成两种细胞的细胞膜损伤,这也是含银产品作用机制之一。然而不同产品对两株细胞膜影响具有差异。A、B产品稀释200倍后对HaCat细胞膜的破坏性仍存在,但这两种样品对于L929细胞未见明显损伤。以上研究表明剂量较高的C产品可能更容易导致细胞存活率下降,A、B产品的剂量较低且不易造成细胞死亡可能更利于创面愈合。不同细胞对银的敏感性不同,建议在评价银离子产品细胞毒性时至少选用两种细胞。4.小鼠创面愈合实验:通过制作小鼠皮肤创面模型来研究各产品对创口愈合的影响。未使用含银产品(空白组)的小鼠一天后的创面面积出现扩大(创面相对面积为1.04±0.00),而使用含银产品的两组小鼠并未出现创面面积扩大现象(创面相对面积分别为0.97±0.02、0.94±0.01)。各组在第三天时的创面愈合相对面积达到近乎相同的水平(创面相对面积分别为0.56±0.01、0.57±0.02、0.56±0.01),在第四天及随后的几天中,各组间创面愈合情况没有显著差异。含银量高的产品,创面的银含量也高,创面银含量与产品银含量呈现出一致性。病理学检查显示,使用含银产品处理的两组创面六天后皮肤组织恢复明显优于空白组,成纤维细胞数量均较多,在新生表皮厚度方面可观察到A产品组≥S产品组>空白对照组。以上结果表明出现创面后即刻使用含银产品,可有效阻止一天后创面的继续扩大。针对100μg/mL和250μg/mL两种剂量来说,产品在创面愈合后期时对创面愈合速率造成的差别并不明显,且此两种剂量产品的创面预后较为相似,A产品在新生表皮厚度方面略有优势,建议产品含银量设置在100μg/mL~250μg/mL区间内较为适宜。5.金属硫蛋白(MT)对银离子所致氧化应激损伤的缓解作用初探:与正常对照组相比,稀释100倍的A产品组(银离子含量约为2.5μg/mL)HaCat细胞内MDA含量增加,GSH含量降低,提示此剂量银离子能够导致细胞内抗氧化防御状态发生改变,对HaCat细胞造成氧化损伤,而加入MT与稀释100倍的A产品共孵育后可以缓解上述改变,提示该浓度MT可以通过提高细胞内抗氧化物酶活性来改善银离子对HaCat细胞的氧化应激损伤。本课题选取的常用含银医用产品处方剂量差异较大,但均符合各产品标示含量要求,敷料产品均匀性及均衡性较好。所选含银产品均没有缓释功能,创面细胞接触的银离子含量接近其本身的含量。含银产品可引起细胞活力和细胞形态学改变,在一定稀释倍比下样品可对L929和HaCat细胞的细胞膜造成不同程度的损伤。小鼠创面实验结果显示,出现创面后即刻使用含银产品,可有效阻止一天后创面的继续扩大,不同产品组间创面银含量呈现剂量对应性,使用含银产品处理的创面六天后皮肤组织恢复明显优于对照组的创面。综上,建议含银创面产品银含量设置在100μg/mL至250μg/mL之间较为适宜。MT可以改善银离子所导致的细胞氧化应激损伤。本研究探讨了含银医用产品可能存在的毒性效应,评价了各产品的创面促愈效果,可为含银医用产品质量控制和监督以及毒性评价提供参考。