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目的:从DJ-1与Grp75蛋白相互作用的角度,探讨在DJ-1介导的心肌细胞缺氧预适应（HPC）延迟保护中,DJ-1蛋白线粒体亚定位的分子机制。方法:1.将大鼠Grp75基因序列（NM001100658.2）作为分析序列,利用设计工具设计靶向Grp75基因的3条候选RNA干扰序列和1条阴性对照序列,再以慢病毒载体（GV112）构建3个靶向Grp75基因的LV-shGrp75-A,B,C重组干扰慢病毒及一个阴性对照的慢病毒。随后,将LV-shGrp75-A,B,C分别感染至H9c2心肌细胞中并以阴性病毒设立对照组,利用Real-time PCR和Western Blot分别检测各组细胞中Grp75基因的mRNA和蛋白水平,以此筛选出Grp75干扰效果最好的重组慢病毒用于后续实验。2.利用H9c2心肌细胞建立HPC模型,24 h后,对细胞进行模拟缺血/再灌注,即缺氧/复氧（H/R）实验。而后,通过免疫共沉淀（Co-IP）检测DJ-1蛋白与Grp75蛋白的结合情况,以此观察心肌细胞HPC预处理对DJ-1蛋白与Grp75蛋白相互作用的影响。3.H9c2心肌细胞经HPC预处理后24 h或经pFlag-DJ-1重组质粒转染48 h后,进行H/R处理,同时结合LV-shGrp75重组干扰慢病毒感染,通过检测以下变化,以此观察HPC预处理及pFlag-DJ-1转染对心肌细胞内DJ-1线粒体转位的影响,并探讨其转位是否需要Grp75蛋白的协助:（1）通过免疫荧光检测细胞内DJ-1与线粒体的共定位情况;（2）分别抽提心肌细胞内胞浆蛋白和线粒体蛋白,Western Blot检测DJ-1蛋白的线粒体转位变化。4.H9c2心肌细胞经HPC预处理后24 h或经pFlag-DJ-1重组质粒转染48 h后,进行H/R处理,同时结合LV-shGrp75重组干扰慢病毒感染,通过检测以下变化,观察下调Grp75表达,抑制DJ-1线粒体亚定位后,是否影响DJ-1蛋白所介导的HPC保护H/R心肌细胞内线粒体复合体I活性,维持线粒体功能:（1）分光光度法检测线粒体复合体I活性;（2）MitoSOX Red荧光探针检测线粒体的超氧化物水平;（3）JC-1荧光探针检测线粒体膜电位。5.H9c2心肌细胞经HPC预处理后24 h或经pFlag-DJ-1重组质粒转染48 h后,进行H/R处理,同时结合LV-shGrp75重组干扰慢病毒感染,通过检测以下变化,观察下调Grp75表达,抑制DJ-1线粒体亚定位后,是否影响DJ-1蛋白所介导的HPC对抗H/R诱发的氧化应激损伤:（1）细胞内MDA含量;（2）抗氧化物酶（SOD、CAT和GPx）的活性变化;（3）MTT法检测细胞存活率;（4）细胞内LDH释放量。结果:1.成功筛选出一条有效的Grp75基因干扰序列,经慢病毒载体感染至H9c2心肌细胞后,与空白对照组相比,Grp75 mRNA和蛋白表达分别降低了77%和74%,能够满足后续实验的需要。2.在H9c2心肌细胞中,HPC预处理可显著上调DJ-1蛋白表达,同时增强Grp75与DJ-1的蛋白相互作用。3.在HPC预处理的H9c2心肌细胞中,DJ-1从胞浆到线粒体的转位明显增加。同时,这种现象在转染了pFlag-DJ-1重组质粒的DJ-1高表达心肌细胞中得于重现,即DJ-1的线粒体转位增加。而更为有趣的是,HPC预处理和pFlag-DJ-1重组质粒转染所产生的上述效应在LV-shGrp75重组慢病毒感染下调Grp75蛋白表达后均被抑制。4.H9c2心肌细胞经HPC预处理后,能显著抑制H/R所致的线粒体复合体I活性下降、线粒体超氧化物水平增加和线粒体膜电位衰减。同样,HPC所产生的上述效应在转染了pFlag-DJ-1重组质粒的DJ-1高表达心肌细胞中得于重现。然而,HPC预处理和pFlag-DJ-1转染后所产生的上述效应均可被LV-shGrp75重组慢病毒感染下调Grp75蛋白表达后所抑制。5.在H9c2心肌细胞中,HPC预处理后24 h可显著减少H/R损伤心肌细胞内MDA的生成、提高抗氧化酶（SOD、CAT及GPx）活性;同时显著提高H/R损伤心肌细胞的生存率,抑制LDH的活性。同样,HPC所产生的上述效应在pFlag-DJ-1转染的心肌细胞中得于重现。此外,HPC预处理和pFlag-DJ-1转染后所产生的上述效应也可被LV-shGrp75重组慢病毒感染下调Grp75蛋白表达后所抑制。结论:在DJ-1介导的心肌细胞HPC延迟保护中,DJ-1通过与Grp75伴侣蛋白结合,在Grp75“分子向导”协助下完成线粒体亚定位,进而保护线粒体复合体I活性,维持线粒体功能,对抗H/R所诱发的氧化应激损伤。