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目的:本研究通过体外培养人牙周膜成纤维细胞(Human periodontal ligament fibroblasts,HPDLF)并构建HPDLF静压力加载模型,慢病毒介导沉默HPDLF的LRP5基因以影响Wnt通路的传导后,观察静压力下HPDLF中OPG与RANKL的表达变化,进一步明确Wnt信号通路是否通过影响RANKL、OPG来调节牙槽骨的改建,探索正畸牙移动过程中牙槽骨改建的可能作用机制。方法:1.收集因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙,并刮取牙根中1/3牙周膜组织块,采取组织块法体外培养HPDLF,细胞免疫荧光法进行鉴定,为后续实验提供细胞。再采用免疫细胞化学SP法对人牙周膜成纤维细胞和人牙龈成纤维细胞(牙龈成纤维细胞由本实验室其他课题组提供)中的LRP5进行检测,明确LRP5是否在牙周组织细胞中表达,并观察其表达特点。2.取第3-5代细胞接种于六孔板,建立HPDLF的体外静压力加载模型。HPDLF分别在不同力值0、1、2、3、4 g/cm2的静压力下加载24h后,采用蛋白印迹法(western blot,WB)检测不同静压力下各组细胞中LRP5蛋白的表达情况。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测HPDLF在2g/cm2静压力下不同加力时间即0、12、24、48h后LRP5mRNA的表达情况。3.慢病毒 shRNA-LRP5 转染 HPDLF,设置五组 MOI=15、25、55、75、100,倒置荧光显微镜下观察空白组(未转染组)、空载转染组及shRNA-LRP5组绿色荧光蛋白的表达情况,以测定最佳的MOI值;再以最佳的MOI值的shRNA-LRP5 病毒转染 HPDLF 细胞,采取 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测此时shRNA-LRP5病毒对HPDLF增殖能力的影响。4.shRNA-LRP5转染HPDLF细胞48h,经嘌呤霉素筛选后,RT-PCR检测LRP5的基因表达,WB检测LRP5的蛋白表达,以明确shRNA-LRP5病毒转染牙周膜成纤维细胞后沉默LRP5的效率。5.沉默HPDLF的LRP5后,2g/cm2的静压力下RT-PCR检测OPG、RANKL和p-GSK-3β的基因表达,WB检测RANKL和p-GSK-3β的蛋白表达,ELISA检测OPG的蛋白表达情况,实验分组:空白对照组、空载转染组、shRNA-LRP5转染组。结果:1.所培养的细胞呈梭形,放射状生长,传代后细胞生长状态稳定。经鉴定细胞来源于间充质细胞,且非上皮来源,并结合取材部位可鉴定为HPDLF。免疫细胞化学检测发现人牙周膜成纤维细胞中有明显LRP5的阳性染色,而牙龈成纤维细胞中LRP5的阳性染色不明显。2.WB检测不同静压力作用下LRP5的表达变化,结果显示:在2g/cm2静压力作用下LRP5的蛋白表达量最高,且随力值增大LRP5表达量下降,差别有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测2g/cm2静压力作用下,不同加力时间对LRP5的影响,结果显示:相比0、12、48h组,24h组的LRP5mRNA表达最为明显,且差别有统计学意义(P<0.05)。3.病毒转染HPDLF后48h,细胞状态良好,且最佳的MOI值为25,显微镜下可见表达绿色荧光蛋白的HPDLF占总细胞的90%以上。CCK-8法检测病毒转染后细胞的增殖能力,空战转染与空白组比较,OD值无统计学差异,shRNA-LRP5组OD值较前两者明显下降(P<0.05)。4.RT-PCR及WB检测慢病毒转染后沉默LRP5的效率,结果显示:与空白组比较,shRNA-LRP5-3组病毒转染HPDLF沉默LRP5的效率高达70%以上(P<0.05),空载转染组LRP5的表达水平无明显下降(P>0.05),成功构建慢病毒载体介导转染人牙周膜成纤维细胞沉默LRP5基因的模型,对人牙周膜成纤维细胞中LRP5的表达具有较高的沉默效率。5.2g/cm2静压力作用下,RT-PCR及WB检测RANKL和p-GSK-3β的基因及蛋白表达,结果显示:空白组与空载转染组中RANKL表达均较低且两者无明显差异(P>0.05),与前两者相比,shRNA-LRP5转染组RANKL表达量明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。而空白组与空载转染组中p-GSK-3β的表达量均高于shRNA-LRP5转染组,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR及ELISA检测OPG基因和蛋白的表达,结果显示:空白组与空载转染组的OPG均有较明显表达且两者无明显差异(P>0.05),相比前两者,shRNA-LRP5转染组OPG表达量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.LRP5在HPDLF中有丰富的表达,在静压力作用下,HPDLF中LRP5表达量随力值不同而出现变化,且变化量有时间依赖性,此外轻力比重力更能刺激HPDLF大量上调LRP5的表达。2.静压力下LRP5基因沉默可下调人牙周膜成纤维细胞中OPG的表达,但使RANKL表达量上调,这表明LRP5可能通过影响RANKL、OPG的表达水平进而影响机械力诱导下的成骨和破骨相关的信号分子,实现骨量的调节,而这一过程很可能由Wnt/β-catenin信号通路介导参与。