牛樟芝是一种只生长于台湾的,具有重要开发价值的珍稀药用真菌,近年来研究表明,樟芝具有保肝、抗氧化、抗炎症、抗癌、提高免疫等诸多生物活性,而三萜是其中最主要的活性物质之一。本文对樟芝固体平板培养、液体培养条件进行了优化,研究了发酵液和菌丝体提取物的抗氧化性能,对三萜类物质提取条件进行了优化,并对三萜进行了进一步的分离提纯和初步鉴定。固体平板培养研究表明:相对于PDA、SDA培养基,MEA培养基更有利于樟芝的生长,生长萌发迅速,菌丝密集并且颜色为橙黄色。虽然樟芝固体培养宏观形态有一定的差异,但是用光学显微镜观察结果显示,其微观形态基本一致,菌丝细,呈树枝状分布,孢子多为椭球状分生孢子,可以被碱性美兰染色。两阶段光照和两阶段温度培养都能使三萜总产量达到相对较高值。研究评估了添加包括碳源、氮源、生长因子在内的16种营养物质,对于樟芝深层发酵中三萜产量的影响。通过Plackett-Burman实验设计,得到麦芽浸粉、麸皮蒸煮液、葡萄糖、甘露醇、牛肉膏、樟脑油这六种物质对于三萜产量有较显著的促进作用。通过单因素实验结合Box-Benhnken实验设计,得到在添加1.5%麦芽浸粉,5%麸皮蒸煮液,3%葡萄糖,0.1%甘露醇,1.0%牛肉浸膏,0.2%樟脑油,0.1%MgSO4·7H2O和0.1%KH2PO4的条件下,三萜产量最大达到6.22 mg/mL。这一结果是优化前的8倍,达到了较好的优化效果,为未来三萜类化合物进一步研究提供了支持。采用甲醇、乙醇、异丙醇对樟芝发酵液和菌丝体进行提取,对其不同提取物进行还原力,DPPH、羟基自由基、超氧自由基、过氧化氢清除能力,亚铁离子螯合能力等抗氧化能力的测定。比较发酵液提取物和菌丝体提取物的抗氧化效果,比较不同提取剂提取物的抗氧化效果。结果显示:(1)发酵液提取物还原力最高的为异丙醇提取物,亚铁离子螯合能力最强的为乙醇提取物;DPPH清除能力乙醇和异丙醇提取物最高都达到97.88%;羟基自由基清除能力最高的为乙醇提取物,达到84.22%;三种提取物的超氧自由基清除能力都较高,具有最高清除率的异丙醇提取物达到94.89%;过氧化氢清除能力最高的为乙醇提取物的97.53%。(2)菌丝体提取物还原力最高和亚铁离子螯合能力最强的均为乙醇提取物;DPPH清除能力最高的为乙醇提取物的89.95%;三种提取物的羟基自由基清除能力普遍偏低,最高的仅为异丙醇提取物的37.28%;超氧自由基清除能力则普遍较1 高,最高为甲醇提取物的90.05%;过氧化氢清除能力最高的为乙醇和异丙醇提取物,最高清除率均为95.06%。抗氧化性能的研究比较,为进一步开发利用樟芝提供了依据。以萃取剂、提取剂、提取方法、提取剂浓度、料液比、时间、温度、功率为工艺参数,通过单因素试验及二次回归正交旋转模型,对三萜类化合物提取条件进行优化。结果显示:最佳萃取剂为二氯甲烷,最佳提取剂为90%乙醇,提取方法为微波辅助提取法。通过回归分析,得到最佳提取工艺条件:料液比51.2,时间9.56min,温度63.2℃,功率613.7W,预测三萜提取量7.91mg/g。结合实际条件,调整提取条件为料液比51,时间9.5min,温度65°℃,功率600W,实际三萜提取量达到7.65 mg/g,与预测值基本相符。以齐墩果酸为标准品进行液相色谱研究,最佳流动相为甲醇:水=90:10,齐墩果酸相对保留时间因浓度和环境差异,略有变化,但基本在7.50min左右;液相色谱齐墩果酸标准曲线为:Y=6375123.6866x(Y为峰面积,x为含量),HPLC重复性检测良好,相对保留时间和峰面积的RSD百分比分别为0.370%和5.813%;分离纯化结果显示:萃取洗涤法比酸碱沉降法的效果好,薄层色谱最佳展开剂为石油醚:乙酸乙酯=2:1,齐墩果酸标准品采用10%硫酸乙醇显色后呈红紫色,Rf值约为0.6。样品在相对位置,也有类似物质。经柱层析分离纯化后,两个样品经初步鉴定,证实为三萜类物质。研究对于樟芝培养发酵及三萜类物质的分离提纯进行初步研究,为后续三萜类物质进一步分离提纯及结构鉴定,生理活性作用研究打下基础。