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牙位移动是口腔正畸治疗的一个基本现象,即在持续、适当的矫治力作用下,错位牙在牙槽骨中逐步发生定向移动。但正畸性牙位移动并不是简单的机械移位,而是伴随着牙周组织,尤其是牙槽骨的应力改建而发生的生物—机械移位过程,骨组织选择性的在一些部位吸收,而在另一些部位形成。在牙槽骨改建过程中,成骨细胞和破骨细胞发挥着重要作用,使得骨形成和骨吸收相互配合,相互协调。其中成骨细胞起着非常关键的作用,其不仅是新骨形成的基础,而且参与了破骨细胞的活化和成熟,但关于成骨细胞的来源目前尚无定论。牙周膜是机械力的直接感受器,因此牙齿移动首先表现为牙周膜反应,继而引发骨的改建。故在此过程中,牙周膜发挥了重要的介导作用。有研究表明,牙周膜中的细胞具有异质性和一定的分化潜能,在机械张应力作用下,其成骨相关标志物核心结合因子α1(Runx2/Cbfa1)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、骨保护素(OPG)等表达可增强。近年来,随着人牙周膜干细胞(PDLSC)的分离成功和研究的不断深入,发现PDLSC具有较大的成骨潜能,在牙周组织的功能稳定和修复再生方面发挥着重要的作用。于是我们推想,作用于牙齿上的正畸力可能促使了PDLSC向成骨细胞分化,继而介导了牙槽骨的应力改建。但目前有关PDLSC在机械应力条件下的研究尚未见报道。本研究将通过PDLSC体外应力实验,探讨牙槽骨应力改建过程中成骨细胞的来源问题,从而进一步揭示牙槽骨应力条件下的改建机理,更好的指导临床正畸治疗和促进牙周健康。目的体外分离、培养PDLSC,并通过细胞张应力实验,证实动态张应力可促使PDLSC向成骨细胞分化。方法1.人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定取12~24岁之间因正畸或阻生而拔除的牙体牙周均健康的新鲜牙齿,冠根单向刮取根中三分之一的牙周膜组织,Ⅰ型胶原酶消化后进行牙周膜细胞原代培养。将原代培养的人牙周膜细胞计数并制备单细胞悬液,通过有限稀释法克隆化培养、分离得到PDLSC,用含10% FBS的α-MEM培养液培养并传代;测定牙周膜细胞克隆形成率;取第4代PDLSC免疫组化检测其角蛋白及波形蛋白表达;流式细胞术分析其细胞周期及表面标志物STRO-1、CD146;并通过成骨、成脂诱导分化实验进行鉴定。2.动态张应力对人牙周膜干细胞成骨相关标志物表达的影响本实验采用Flexcell FX-4000T Tension Plus System(FX-4000T加载系统)进行张应力加载,将4~6代PDLSC种于BioFlex加载专用六孔培养板,在矿化诱导环境下分别加载三组不同形式的张应力,各组作用时间均为6 h、12 h、24 h,对照组只在BioFlex板中静置培养;以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白免疫印迹技术(WB)检测不同张应力作用前后,PDLSC成骨相关标志物Runx2、ALP、OCN在mRNA和蛋白水平表达的变化情况。3.动态张应力对人牙周膜干细胞表面标志物CD146表达的影响将4-6代PDLSC种于BioFlex加载专用六孔培养板,置于FX-4000T加载系统中,在矿化诱导环境下分别加载三组不同形式的动态张应力,各组作用时间均为6h、12h、24h,对照组只在BioFlex板中静置培养;以real-time PCR和WB分析PDLSC在不同张应力作用前后,其表型标志CD146在mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果1.原代培养的人牙周膜细胞为长梭形或不规则形;通过改良法克隆化培养成功得到PDLSC,其与牙周膜细胞形态相似,为梭形、多角形或不规则形,体积稍小,呈漩涡状或放射状排列;克隆形成实验测得所得细胞具有较高的克隆形成率;免疫组化检测发现PDLSC角蛋白表达阴性,波形蛋白阳性,说明所得细胞均来自于中胚层;流式细胞术结果显示所得PDLSC具有慢周期性的特点,并且高表达间充质干细胞标志物STRO-1和CD146;成骨诱导后光镜下可见矿化结节,茜素红染色阳性;成脂诱导后,光镜下可见脂滴形成,油红O染色阳性,说明所得细胞具有多向分化能力。2.人牙周膜干细胞成骨相关标志物表达的变化通过FX-4000T加载系统对PDLSC进行不同时段、不同张应力加载后发现:在矿化诱导环境中,PDLSC成骨早期相关标志物Runx2、ALP和晚期标志物OCN的mRNA表达水平均随时间而升高,但各张应力组升高水平更加显著,并且不同张应力对目标基因升高水平的程度也有不同的影响,其中12%-0-12%作用形式的动态张应力使各成骨基因水平升高最多,而静张力只对ALP升高作用明显。各标志物在蛋白水平的检测也显示了和mRNA相一致的结果。3.人牙周膜干细胞表面标志物CD146的表达变化通过FX-4000T加载系统对PDLSC进行不同时段、不同张应力加载后发现:各组中CD146的表达随时间而持续减弱,但在各张应力组中其表达水平下降的更明显,尤其是在加载前12 h,其mRNA和蛋白水平均显著下降。但不同张应力对CD146表达降低的影响无显著差异。结论1.改良法克隆化培养可成功从牙周膜中分离得到PDLSC,所得细胞具有较高的克隆形成率,表达间充质干细胞标志物STRO-1和CD146,具有干细胞慢周期性和多向分化能力的特点。2.本研究第一次通过体外细胞应力实验观察并证实动态张应力可促使PDLSC向成骨细胞分化,说明PDLSC可能是牙槽骨应力改建过程中成骨细胞的重要来源。结果还显示不同形式的张应力具有不同的促成骨作用,其中以12%-0-12%作用形式的动态张应力促成骨作用最强,静张力促成骨作用相对较弱,这对口腔正畸临床治疗具有一定的指导意义。3.动态张应力可使得PDLSC的多向分化能力持续减弱,即PDLSC的干细胞特性发生改变。