可再生资源利用是人类可持续生存和经济可持续发展的基础，自然界最丰富的可再生资源是纤维素类物质，总量占全部可再生资源的80％。尽管纤维素类有多种用途，但为人类提供食品是其最主要的功能，而将这类物质转化为食品的唯一且高效途径是反刍动物，但反刍动物本身并不能消化纤维素类物质，必须依赖栖居在瘤胃中的大量微生物。 但由于瘤胃微生物系统的复杂性，至今人们对其认识尚甚少。对瘤胃微生物的研究经历了三个阶段，现正在进入第四阶段——生物技术阶段，以16S rDNA序列为指标的物种进化和多样性分析使认识和了解瘤胃微生物更加简捷和有效；酶基因重组和再转入对调节和改善瘤胃代谢也有显著作用。 牦牛是生活于高寒地带的、受人类活动影响最少的、具有典型地方特色的动物，以天然牧草为唯一饲料来源，生活环境保持在自然、原始状态，其瘤胃微生物有其显著的环境和地理特征：结构完整、保存完善且未受污染。由于这些原因，特别是饲料类型比较单一且恒定，瘤胃微生物群落和组成保持在原始稳定状态，是研究瘤胃微生物最好的出发材料，其资源特性更加明显，特别是纤维素、木质素分解类微生物是可再生资源利用和环境保护的重要微生物资源。 为尽可能了解牦牛的瘤胃微生物组成和特点、保护其微生物基因资源和为进一步研究构建技术平台，本项目进行了如下几方面的研究： 1、牦牛瘤胃内容物微生物总DNA提取及性质分析 目的：由牦牛瘤胃内容物高效获得尽可能全面代表瘤胃微生物种类的、全面保存遗传资源的、片段尽可能大的、不被其它来源DNA污染的可用于分子生物学研究的微生物遗传物质。 结果：实验了液氮、干冰—酒精冻融法和离心沉淀—碱裂解法提取微生物总DNA的方法，结果证明干冰-酒精冻融法获得的DNA片段较大，每克瘤胃内容物获粗制DNA40μg，经纯化得20kb以上的DNA 15μg。经Pst Ⅰ和Eco RV 耗斗疗胄微生物基因组文瘁构丈与165 ro＊A生抽多佯性研允 ＊bs汀SCt 酶切检验证明符合分子生物学操作要求，且未被其它来源的DNA污染。 2、牦牛瘤胃内容物微生物基因组文库构建 目的：建立覆盖面广、具有重要基因资源保护和进一步筛选有价值基因的 基因组文库。 结果：以提取并纯化的牦牛瘤胃内容物微生物总DNA为出发材料、以 pKC505粘粒为载体构建了 cosmid基因组文库。经检验文库滴度为 6．7 XI 0’／pg 基因组 DNA，插入片段长度 17上5kb，平均 21．skb，包含 1．4405 X 10’个碱基 的重组基因组序列，是一个覆盖面广、功能完善的基因组文库。这一文库的构 建为研究和利用具有典型地方特色的牦牛瘤胃微生物资源提供了技术平台。．3、牦牛瘤胃微生物 16s rDNA生物多样性研究及与晋南黄牛的比较il 目的：以役肉兼用型晋南黄牛为比较对象研究牦牛瘤胃的微生物生物多样 性，了解其组成和特点，为进一步研究瘤胃微生物生态提供依据。 结果：以甘肃天祝牦牛和晋南黄牛瘤胃内容物微生物总DNA为模板，以．通用引物530f和 1492r经聚合酶链式反应（PCR）扩增构建 16s rDNA文库，l．随机挑取阳性克隆子进行部分序列测定，分别获得 184个和 ZIS个有效序列，＋．经与GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB基因序列数据库比对及DNAMAN软件分 析，结果表明：①样品总DNA提取方法合理，经PCR扩增获得了覆盖广范的【16s rDNA序列，且没有被其它来源的 DNA污染；②采用 30次PCR循环获得Z 了良好的 16s序列覆盖；③牦牛瘤胃微生物组成以分解纤维类物质为主，未发5 现分解淀粉的微生物，而黄牛瘤胃微生物中纤维素分解菌比例较低，但淀粉分R3解菌的序列显著较多。同时分析表明，牦牛瘤胃微生物 184个序列中最接近未：培养种类达 144 个，而黄牛为 218 个中 127 个，分别占 78．26O和 58．25O，黄二 牛的瘤胃微生物组成与已报道的奶牛、肉牛接近，所以牦牛瘤胃微生物组成和．种类可代表最原始和最稳定的瘤胃微生物结构，其资源价值更高，具备用于可l 再生资源开发的潜力。研究结果的16s n3：NA序列共370个提交并注册到国际2 基因数据库，其中牦牛183个，黄牛187个，注册号分别为AY311600－AY3ll782（ ＄0 AY315198－AY315384。