论文部分内容阅读
猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)引起的以母猪特别是初产母猪不孕、流产,产出死胎、畸胎、木乃伊胎以及弱仔为特征的繁殖障碍性疾病。该病在全球范围内广泛存在,给养猪业造成了重大的经济损失。为了加强对该病的疫情监测和流行病学调查,有必要研究开发出一种特异性强和敏感性高的血清学检测试剂。PPV的结构蛋白VP2(Structural Protein 2)具有良好的免疫原性,可作为理想的血清学检测用抗原[1]。另外,PPV持续感染的猪体内会产生抗非结构蛋白NS1 (Nonstructural Protein 1)的抗体,据此,NS1可作为诊断用抗原来区别灭活苗免疫和自然感染。本研究利用大肠杆菌表达系统表达了PPV VP2和NS1蛋白的主要抗原表位区,获得了纯化的重组蛋白,用纯化的VP2重组蛋白初步建立了间接VP2-ELISA,并对NS1重组蛋白的适用性进行研究。主要研究内容如下:一、猪细小病毒结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1主要抗原区的原核表达参照GenBank发表的PPV中国株基因序列,分别设计出针对VP2和NS1的引物,通过PCR方法扩增出包含VP2和NS1主要抗原表位区509bp和698bp的基因片断,克隆到pGEM-T-Vector上,再分别插入到原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,建立pET-VP2和pET-NS1两个重组表达载体,将载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物分子量大小分别为39.1KDa和45KDa。经BandScan软件分析,表达量分别占菌体蛋白的65.2%和53.1%。Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白均能与PPV阳性血清发生特异性反应。表达产物经His·Bind亲和层析法纯化后,获得的重组蛋白VP2和NS1的浓度达到1.53mg/ml和0.35mg/ml。二、猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法的初步建立将纯化后的重组蛋白VP2作为抗原包被聚乙烯微量反应板,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,初步建立了针对VP2抗体的间接VP2-ELISA。对ELISA各种反应条件进行优化,确定了最适工作条件。研究结果表明,重组抗原最适包被浓度为306ng/孔,4℃包被过夜,待检血清最适稀释度为1:50。待检血清和酶标二抗的反应时间分别为37℃,30min和37℃,15min;底物37℃显色10min,读OD450值。血清样品OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判为阳性。用建立的间接VP2-ELISA分别检测猪圆环病毒病、伪狂犬病、猪瘟、猪日本脑炎和猪繁殖与呼吸综合征阳性血清,结果均为阴性,说明该方法具有高度的特异性。批间、批内重复性试验结果变异系数均小于10%。与Ceditest? PPV ELISA试剂盒相比,间接VP2-ELISA方法的敏感性和特异性分别为93.8%(61/65)和81.1%(30/37),符合率为89.2%(91/102)。说明该方法具有较好的敏感性和特异性,可用于PPV血清抗体的检测。