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目的探讨建立CD88表型肥大细胞的方法,研究融合蛋白C5a刺激肥大细胞脱颗粒情况,利用氯化钴刺激肝实质细胞,建立肝实质细胞缺氧损伤模型,将脱颗粒的肥大细胞与肝实质细胞AML12共培养,观察肥大细胞脱颗粒对受损肝实质细胞的影响。方法 (1)提取骨髓源肥大细胞和皮肤源肥大细胞,流式鉴定肥大细胞表型以及甲苯胺蓝法鉴定肥大细胞;(2)应用PMA或者离子霉素处理骨髓源肥大细胞和P815细胞后,流式鉴定其CD88表达情况,并寻找PMA和离子霉素刺激肥大细胞表达CD88的合适处理时间以及剂量;(3)蛋白免疫印迹法(Western blot)分析检测肥大细胞CD88、β-actin蛋白的表达水平的影响;(4)应用C5a融合蛋白刺激CD88表型的肥大细胞,β-内酰胺酶法检测肥大细胞脱颗粒情况;(5)应用氯化钴处理肝实质细胞AML12建立肝缺氧模型;(6)将脱颗粒的肥大细胞与受损的肝实质细胞AML12共培养,观察肥大细胞脱颗粒对受损肝实质细胞的影响。结果(1)通过细胞因子诱导分化,一段时间后可以获得大量高纯度的肥大细胞,皮肤提取肥大细胞未能获得肥大细胞;(2)骨髓源肥大细胞经过PMA或者离子霉素刺激后,流式检测其CD88表达明显上升,在时间和剂量的对比试验中发现,PMA和离子霉素刺激肥大细胞表达CD88的最适时间为24h,最适宜浓度分别为50ng/ml和1000ng/ml,而P815肥大细胞株未出现明显的CD88表达;(3)蛋白免疫印迹法结果提示:与未经PMA或离子霉素刺激的肥大细胞相比,经过刺激的肥大细胞,其CD88蛋白的表达明显增加;(4)融合蛋白C5a刺激CD88表型肥大细胞后,应用β-内酰胺酶法测肥大细胞脱颗粒发现,与未加C5a的对照组相比,其脱颗粒明显增加,且随融合蛋白C5a加入浓度的增加而增加,呈现出浓度依赖性;(5)根据文献报道,经过预实验,寻找合适的氯化钴浓度来建立肝实质细胞的缺氧损伤;(6)应用氯化钴建立肝实质细胞受损模型后发现,在轻微的肝实质细胞受损情况下,肥大细胞脱颗粒能够刺激肝实质细胞反应性的增生,而在重度肝实质细胞受损的情况下,肥大细胞脱颗粒能够进一步促进损伤的发生,发挥抑制肝实质细胞增殖的作用。结论通过细胞因子诱导可以获得大量高纯度的肥大细胞,经过PMA或离子霉素刺激后,其表面CD88表达明显上升,经C5a刺激后,肥大细胞脱颗粒并呈现浓度依赖性,脱颗粒的肥大细胞可以抑制重度受损的肝实质细胞增殖。