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目的：
通过对大鼠骨骼肌损伤再生修复过程中骨骼肌组织及卫星细胞经典Wnt通路相关基因表达影响的研究，以期为损伤时间的准确推断提供依据，并讨论经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制。
方法：
1.动物分组及模型制备：于山西医科大学动物中心购得276只健康成年SD大鼠(200±5g)。①84只用于HE染色及组织冰冻切片免疫荧光染色。依据损伤时间不同随机分为14个组(n=6)：空白对照组、损伤0h、4h、8h、12h、24h、48h、60h、3d、4d、5d、6d及7d组。②采用双酶消化法及差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度法分离、提取、纯化卫星细胞，并于体外环境下继续培养。③36只采用CCK-8细胞增殖实验对激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974作用于卫星细胞的最适浓度进行摸索。动物进行随机分组：空白对照组、激活剂Wntagonist1组和抑制LGK-974组，每组6只(n=6)。采用不同浓度梯度的激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974预处理卫星细胞1d、2d、3d及4d；对照组不进行任何干预。④156只用于卫星细胞体外干预实验中卫星细胞的细胞免疫荧光染色。动物进行随机分组：空白对照组、激活剂Wntagonist1组和抑制LGK-974组，各组再按照预处理时间不同(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)分为13个组，每组12只(n=6)。采用改良自由落体法制备大鼠骨骼肌挫伤模型，对照组大鼠不致损伤。
2.HE染色：将提取的组织固定于4%多聚甲醛溶液48h后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，切片厚5μm，经常规HE染色，二甲苯透明、中性树胶封片后，采用TissueFAXS200仪器对切片进行扫描，观察骨骼肌损伤区域的病理组织学特点。
3.组织冰冻切片免疫荧光染色：应用Pax7、MyoD、MyoG抗体对骨骼肌组织冰冻切片进行免疫荧光染色，使用FL-StrataQuest软件对荧光结果进行分析。
4.卫星细胞提取及纯化：使用两步酶消化法(Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶)以及差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法从大鼠左后肢骨骼肌中分离提取卫星细胞。
5.经典Wnt通路激活剂/抑制剂最佳浓度实验：采用CCK-8细胞增殖实验对激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974作用于卫星细胞的最适浓度进行摸索。从挫伤大鼠骨骼肌中提取卫星细胞，将提取的适当浓度的细胞样本接种于平底96孔板中，于细胞培养箱中分别培养1d、2d、3d及4d，滴加CCK-8，采用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值(OD450)。
6.经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制实验：应运最适浓度的激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974对体外环境下培养的卫星细胞进行人为干预，采用细胞免疫荧光染色技术检测卫星细胞Pax7、β-catenin、MyoD及MyoG的表达，使用FL-StrataQuest软件对荧光结果进行分析。
结果：
1.HE染色结果显示：骨骼肌损伤后，肌纤维坏死及炎性细胞浸润和大量新生纤维组织修复等过程，证明本次实验造模成功，可进行后续实验。
2.组织切片免疫荧光染色结果显示：Pax7、MyoD、MyoG蛋白的表达呈现时序性变化。单位面积内Pax7与MyoD阳性细胞的数量在损伤3d达到峰值，且与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；单位面积内MyoG阳性细胞的数量在损伤3d后开始增加，并一直持续到损伤7d，且相比于对照组具有统计学的差异(P<0.05)。
3.通过采用前期提取卫星细胞的方法结合Percoll不连续密度梯度离心法，可以提取到纯度更高的卫星细胞，可以用于后续的体外环境细胞干预实验。
4.经典Wnt通路激活剂/抑制剂最佳浓度实验结果：在体外培养环境下，激活剂Wntagonist1对卫星细胞在预处理早期1d及2d有促进细胞增殖的作用；而在3d及4d时，则会促进细胞漂浮死亡；5μmol/mL作为激活剂Wntagonist1的最适作用浓度。抑制剂LGK-974在高浓度100nmol/mL及1000nmol/mL抑制细胞增殖的作用显著，但在后者抑制效果更加明显，选择1000nmol/mL作为抑制剂LGK-974的最适作用浓度。
5.经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制实验结果：①组内比较：对照组、激活剂Wntagonist1组及抑制剂LGK-974组，单个细胞Pax7、β-catenin、MyoD及MyoG平均荧光强度呈现时序性变化。②组间比较：激活剂Wntagonist1组同对照组相比：单个细胞Pax7及β-catenin平均荧光强度在8h时，荧光强度增强；而单个细胞MyoD平均荧光强度在36h时才出现增强；对于MyoG，出现荧光强度弱于对照组的情况。抑制剂LGK-974同对照组相比：单个细胞Pax7平均荧光强度在0h、8h时即有所下降，4d至7d时则更显著；而单个细胞β-catenin、MyoD及MyoG平均荧光强度表达趋势与Pax7相似，但都要低于对照组。在激活剂Wntagonist1组与抑制剂LGK-974组相比：单个细胞Pax7及β-catenin平均荧光强度在8h时，荧光强度增强；而单个细胞MyoD及MyoG平均荧光强度表达趋势则要低于抑制剂LGK-974组。
结论：
经典Wnt通路在成体骨骼肌损伤后再生修复过程中起重要作用，其相关基因在损伤后呈时序性变化。Wntagonist1对细胞的干预呈现双重作用，在早期促进卫星细胞增殖，而后期则使细胞漂浮死亡；LGK-974可通过减缓卫星细胞的增殖，加速卫星细胞的分化，导致卫星细胞池的耗竭，从而干扰挫伤组织的再生修复过程。
通过对大鼠骨骼肌损伤再生修复过程中骨骼肌组织及卫星细胞经典Wnt通路相关基因表达影响的研究，以期为损伤时间的准确推断提供依据，并讨论经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制。
方法：
1.动物分组及模型制备：于山西医科大学动物中心购得276只健康成年SD大鼠(200±5g)。①84只用于HE染色及组织冰冻切片免疫荧光染色。依据损伤时间不同随机分为14个组(n=6)：空白对照组、损伤0h、4h、8h、12h、24h、48h、60h、3d、4d、5d、6d及7d组。②采用双酶消化法及差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度法分离、提取、纯化卫星细胞，并于体外环境下继续培养。③36只采用CCK-8细胞增殖实验对激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974作用于卫星细胞的最适浓度进行摸索。动物进行随机分组：空白对照组、激活剂Wntagonist1组和抑制LGK-974组，每组6只(n=6)。采用不同浓度梯度的激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974预处理卫星细胞1d、2d、3d及4d；对照组不进行任何干预。④156只用于卫星细胞体外干预实验中卫星细胞的细胞免疫荧光染色。动物进行随机分组：空白对照组、激活剂Wntagonist1组和抑制LGK-974组，各组再按照预处理时间不同(0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d)分为13个组，每组12只(n=6)。采用改良自由落体法制备大鼠骨骼肌挫伤模型，对照组大鼠不致损伤。
2.HE染色：将提取的组织固定于4%多聚甲醛溶液48h后，进行脱水、透明、浸蜡、包埋，切片厚5μm，经常规HE染色，二甲苯透明、中性树胶封片后，采用TissueFAXS200仪器对切片进行扫描，观察骨骼肌损伤区域的病理组织学特点。
3.组织冰冻切片免疫荧光染色：应用Pax7、MyoD、MyoG抗体对骨骼肌组织冰冻切片进行免疫荧光染色，使用FL-StrataQuest软件对荧光结果进行分析。
4.卫星细胞提取及纯化：使用两步酶消化法(Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶)以及差速贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法从大鼠左后肢骨骼肌中分离提取卫星细胞。
5.经典Wnt通路激活剂/抑制剂最佳浓度实验：采用CCK-8细胞增殖实验对激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974作用于卫星细胞的最适浓度进行摸索。从挫伤大鼠骨骼肌中提取卫星细胞，将提取的适当浓度的细胞样本接种于平底96孔板中，于细胞培养箱中分别培养1d、2d、3d及4d，滴加CCK-8，采用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值(OD450)。
6.经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制实验：应运最适浓度的激活剂Wntagonist1及抑制剂LGK-974对体外环境下培养的卫星细胞进行人为干预，采用细胞免疫荧光染色技术检测卫星细胞Pax7、β-catenin、MyoD及MyoG的表达，使用FL-StrataQuest软件对荧光结果进行分析。
结果：
1.HE染色结果显示：骨骼肌损伤后，肌纤维坏死及炎性细胞浸润和大量新生纤维组织修复等过程，证明本次实验造模成功，可进行后续实验。
2.组织切片免疫荧光染色结果显示：Pax7、MyoD、MyoG蛋白的表达呈现时序性变化。单位面积内Pax7与MyoD阳性细胞的数量在损伤3d达到峰值，且与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)；单位面积内MyoG阳性细胞的数量在损伤3d后开始增加，并一直持续到损伤7d，且相比于对照组具有统计学的差异(P<0.05)。
3.通过采用前期提取卫星细胞的方法结合Percoll不连续密度梯度离心法，可以提取到纯度更高的卫星细胞，可以用于后续的体外环境细胞干预实验。
4.经典Wnt通路激活剂/抑制剂最佳浓度实验结果：在体外培养环境下，激活剂Wntagonist1对卫星细胞在预处理早期1d及2d有促进细胞增殖的作用；而在3d及4d时，则会促进细胞漂浮死亡；5μmol/mL作为激活剂Wntagonist1的最适作用浓度。抑制剂LGK-974在高浓度100nmol/mL及1000nmol/mL抑制细胞增殖的作用显著，但在后者抑制效果更加明显，选择1000nmol/mL作为抑制剂LGK-974的最适作用浓度。
5.经典Wnt通路参与损伤骨骼肌再生修复的机制实验结果：①组内比较：对照组、激活剂Wntagonist1组及抑制剂LGK-974组，单个细胞Pax7、β-catenin、MyoD及MyoG平均荧光强度呈现时序性变化。②组间比较：激活剂Wntagonist1组同对照组相比：单个细胞Pax7及β-catenin平均荧光强度在8h时，荧光强度增强；而单个细胞MyoD平均荧光强度在36h时才出现增强；对于MyoG，出现荧光强度弱于对照组的情况。抑制剂LGK-974同对照组相比：单个细胞Pax7平均荧光强度在0h、8h时即有所下降，4d至7d时则更显著；而单个细胞β-catenin、MyoD及MyoG平均荧光强度表达趋势与Pax7相似，但都要低于对照组。在激活剂Wntagonist1组与抑制剂LGK-974组相比：单个细胞Pax7及β-catenin平均荧光强度在8h时，荧光强度增强；而单个细胞MyoD及MyoG平均荧光强度表达趋势则要低于抑制剂LGK-974组。
结论：
经典Wnt通路在成体骨骼肌损伤后再生修复过程中起重要作用，其相关基因在损伤后呈时序性变化。Wntagonist1对细胞的干预呈现双重作用，在早期促进卫星细胞增殖，而后期则使细胞漂浮死亡；LGK-974可通过减缓卫星细胞的增殖，加速卫星细胞的分化，导致卫星细胞池的耗竭，从而干扰挫伤组织的再生修复过程。