非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种以肝脂沉积为特征的、与胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver, NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。目前NAFLD已成为西方国家中最常见的一种肝脏疾病，普通成人的发病率为20％-30％;在亚太地区，由于生活方式的改变，其发病率也在飞速增长，约为12-24％。并且，随着经济发展和不良生活方式的影响，非酒精性脂肪肝还逐渐呈现出低龄化的趋势，因此，非酒精性脂肪肝已经成为21世纪全球重要的公共健康问题之一。　　 肝脂沉积(hepatic steatosis)是非酒精性脂肪肝发生发展过程中的一个重要的病理生理阶段，亦是非酒精性脂肪肝的特征性改变和诊断金标准。既往认为肝脂变是一种良性病变，但近年愈来愈多的研究证实，肝脂变可进展到更为严重的肝脏损伤如肝纤维化、肝硬化、肝癌;并且肝脂沉积被认为是代谢综合征(metabolic syndrome，MS)在肝脏的一种表现，非酒精性脂肪肝患者更易于并发肥胖、糖尿病和心脑血管疾病而导致相关的致死致残率上升，因此，肝脂肪变性值得重视。　　 多项研究表明，肝脂变是肝脏脂质代谢各通路之间平衡失调的结果，脂质从头合成途径和脂酸氧化途径是脂质代谢通路中的两条重要途径，而固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c）和过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferativeactivated receptor，PPARα)分别是调控这两条途径中的重要的上游转录因子，其下游的关键靶基因包括乙酰辅酶羧化酶(acetyl-CoA carboxylasesynthetase，ACC)、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT2）、肉毒碱棕榈酰基转移酶（camitine palmitoyltransferase，CPT1A）等等。目前，以上述通路的关键酶作为干预靶点的相关药物研发已逐渐成为非酒精性脂肪肝防治中的研究热点，但存在的问题是:作用靶点单一、副作用程度不一、药物研发成本偏高等。　　 氧化苦参碱（oxymatrine，OMT），分子式为C15H24N2O，是从中药苦参、苦豆子、广豆根中提取的提取的一种中药单体，药理作用广泛，如:抗病毒、抗炎、杀菌、抗肿瘤、抗氧化应激及保肝及抗肝纤维化、抗心律失常等。研究发现，与其化学结构相似的苦参碱可减少肝脂沉积、改善脂代谢，不论是在体内实验还是体外实验中。本课题组前期的研究结论与此一致。因此，推定氧化苦参碱对非酒精性脂肪肝的防治应具有一定疗效，尤其是针对病毒性肝炎并发肝脂沉积的患者，更具临床应用价值;目前，国内外相关研究文献检索到2篇，均证实氧化苦参碱确能减少肝脂沉积，与我们的推测相一致。但对于该药物减少肝脂沉积的分子机制方面的研究还未见有报道。　　 本研究以高果糖饮食喂饲大鼠建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，给予不同剂量的氧化苦参碱进行干预治疗，观察其对大鼠肝脏脂质沉积的影响，以及对该模型的一般生理指标、病理形态的影响;并进一步检测氧化苦参碱对脂质从头合成途径、脂质氧化途径的关键酶的影响，以及掌控脂质代谢通路上游转录因子的变化，以深入探讨氧化苦参碱对肝脂代谢的影响和相关机制，为临床拓展氧化苦参碱的治疗范围提供实验基础和理论依据。　　 第一部分氧化苦参碱对非酒精性脂肪肝大鼠代谢指标的影响。　　 目的:　　 1、观察氧化苦参碱对高果糖导致的大鼠非酒精性脂肪肝模型一般代谢指标的影响。　　 2、观察氧化苦参碱对高果糖导致的大鼠非酒精性脂肪肝模型的脂质沉积的影响。　　 方法:　　 清洁级健康雄性wistar大鼠52只，体重（176～190克），购自河北医科大学实验动物中心并在室温控制于22～28℃之间，相对湿度40％-60％之间的环境中饲养，每日保证12小时光照，昼夜循环。自由进食和饮水。适应性喂养一周随机分为2组:正常饮食组（standard diet group，SD）和高果糖饮食组(high fructose diet group，HFD)，8周后，随机抽取4只大鼠，留取部分肝组织，送检光镜标本以证实非酒精性脂肪肝动物模型成立。然后将高果糖饮食组随机分为5个亚组:高果糖饮食组(HFD)、氧化苦参碱低剂量组(OMT40)、氧化苦参碱中剂量组(OMT80)、氧化苦参碱高剂量组(OMT160)、非诺贝特组（fenofibrate group，FF）。其中，正常饮食组和高果糖饮食组给予溶剂0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，氧化苦参碱各剂量组分别给予40、80、160 mg/kg的氧化苦参碱溶于0.5％羧甲基纤维素钠后灌胃，非诺贝特组给予30 mg/kg的非诺贝特溶于0.5％羧甲基纤维素钠后灌胃，每日定时灌胃1次，干预8周。实验期间，每日记录进食量(g)并换算为热量(kcal)，每周测量空腹体重。于实验16周末，各组随机抽取4只大鼠行正糖高胰岛素钳夹实验评估胰岛素敏感性，随机抽取6只大鼠行腹膜下糖耐量实验(IPGTT)，其余大鼠禁食10小时过夜，3％戊巴比妥钠麻醉后采集标本检测下列指标:肝重量（计算肝指数）、全自动生化仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，试剂盒检测游离脂肪酸(FFA)、肝TG含量;酶法测定空腹血糖(FBG);放免法检测血清空腹胰岛素(Fins);对肝组织进行病理学检查，HE染色及油红O染色观察其脂肪变程度;电镜了解超微结构改变。并留取部分肝组织液氮速冻后移至-70℃冰箱保存备用。计量资料结果以(x)±s表示，两组间比较采用t-test。多组间比较采用One way ANOVA，首先对数据进行方差齐性检验，方差齐则用LSD法进间两两比较，如果数据方差不齐，则采用Welch法进行方差分析，应用Dunnett T3法进行两两比较。等级资料资料采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行分析，P＜0.05为有显著性差异。所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析。　　 结果:　　 1、各组大鼠体重、肝指数、摄入热量比较:各组大鼠间体重无明显差异(P＞0.05);高果糖组肝指数明显高于正常对照组(P＜0.05)，氧化苦参碱各剂量组可明显降低肝指数(P＜0.05或P＜0.01)，而非诺贝特组肝指数无明显降低(P＞0.05);各组大鼠间摄入热量无明显差异(P＞0.05)。　　 2、各组大鼠血脂、肝功、血游离脂酸水平比较:高果糖组血TC、TG、LDL、FFA及ALT明显高于正常对照组(P＜0.05或P＜0.01)，血HDL明显低于正常对照组(P＜0.01);氧化苦参碱各剂量组可明显降低血TC、TG、LDL、FFA(P＜0.05或P＜0.01)，升高血HDL水平(P＜0.05或P＜0.01)，尤以中、高剂量组为明显;但中、高剂量组之间差异不明显;非诺贝特组可明显降低血TC、TG、LDL、FFA(P＜0.05)，升高血HDL水平(P＜0.05)，但对血ALT无明显影响（P＞0.05）。　　 3、各组大鼠肝甘油三酯含量比较:高果糖组肝TG含量明显高于正常对照组（P＜0.01），氧化苦参碱各剂量组可明显降低肝TG含量(P＜0.05或P＜0.01)，具有剂量依赖性，非诺贝特组也可明显降低肝TG含量（P＜0.05）。　　 4、各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、糖耐量结果比较:各组大鼠血FBG无明显变化(P＞0.05);高果糖组大鼠血Fins明显高于正常对照组(P＜0.01)，氧化苦参碱各组和非诺贝特组可明显降低血Fins水平(P＜0.05或P＜0.01);在IPGTT实验中，高果糖组30分、60分、120分血糖明显升高（P＜0.05或P＜0.01），葡萄糖曲线下面积显著高于正常对照组(P＜0.05)，升高34.98％;氧化苦参碱各剂量组可明显降低葡萄糖负荷后的血糖水平和葡萄糖曲线下面积(P＜0.05或P＜0.01)，非诺贝特对葡萄糖负荷后的血糖水平和葡萄糖曲线下面积无明显影响（P＞0.05）。　　 5、各组大鼠正糖-高胰岛素钳夹实验结果比较:高果糖组葡萄糖输注率显著低于正常组（P＜0.05），提示存在胰岛素抵抗;氧化苦参碱中、高剂量组和非诺贝特组葡萄糖输注率较高果糖组升高（P＜0.05），提示胰岛素抵抗改善。　　 6、各组大鼠肝脏组织光镜结果比较:HE染色显示正常对照组大鼠肝细胞结构完整，胞浆均匀红染，未见脂滴空泡，高果糖组肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝窦扩张，肝细胞肿胀明显，细胞质内可见大小不等，数量不一的圆形脂肪空泡;氧化苦参碱低、中、高剂量组随剂量增加，肝细胞内脂滴逐渐减少，其中高剂量组变化最为明显，肝小叶结构基本正常，肝细胞内脂滴明显减少。非诺贝特组肝小叶结构基本正常，肝细胞内有局部脂肪空泡，肝细胞轻度水样变。　　 油红O染色显示正常对照组大鼠肝细胞结构完整，显示胞浆呈淡蓝色，未见红色脂滴;高果糖组大鼠肝细胞内可见大小不等的红色脂滴，出现明显的肝细胞脂肪变性及脂质沉积;氧化苦参碱各剂量组和非诺贝特组的红色脂滴均有不同程度地减少。　　 结论:　　 1、热量比为34.5％的高果糖饮食喂饲大鼠16周可建立非酒精性脂肪肝病变大鼠模型，表现为肝脂肪沉积、血脂异常、血FFA升高、转氨酶升高、糖耐量异常和胰岛素抵抗，但体重、摄入热量和空腹血糖无明显差异。　　 2、氧化苦参碱低、中、高剂量组和非诺贝特组可不同程度地改善高果糖饮食导致的大鼠肝脂肪变性、血脂异常、血FFA升高和胰岛素抵抗，同时氧化苦参碱各剂量组具有保护肝功能、降低转氨酶、改善糖耐量的作用，而非诺贝特对肝功能和糖耐量无明显影响。　　 第二部分氧化苦参碱对脂代谢通路中脂质从头合成途径关键酶的影响。　　 目的:　　 1、探讨氧化苦参碱对脂质从头合成途径关键酶FAS酶活性的影响。　　 2、探讨氧化苦参碱对脂质从头合成途径中的关键酶ACC、FAS和DGAT2的基因表达水平的影响。　　 3、探讨氧化苦参碱对脂质从头合成途径中的关键酶ACC、FAS和DGAT2的蛋白表达水平的影响。　　 方法:　　 动物分组、标本采集、统计方法同第一部分。FAS酶活性测定依据文献;ACC、FAS和DGAT2的mRNA水平检测采用实时荧光定量PCR技术;ACC、FAS和DGAT2的蛋白表达水平分析采用Western blot技术。　　 结果:　　 1、各组大鼠FAS酶活性比较:高果糖组大鼠肝脏中FAS酶活性明显高于正常对照组，升高了420.85％(P＜0.01);氧化苦参碱低、中、高剂量组的FAS酶活性较高果糖组分别降低27.01％（P＜0.05），40.53％(P＜0.05)和44.5％(P＜0.05);非诺贝特组FAS酶活性与高果糖组相比，无明显降低（P＞0.05）。　　 2、各组大鼠ACC、FAS和DGAT2的mRNA水平比较:高果糖组大鼠肝脏组织中ACC、FAS和DGAT2的mRNA水平明显高于正常对照组(P＜0.01)，分别升高了288％、332％和511％;氧化苦参碱低、中、高剂量组ACC的mRNA水平较高果糖组分别降低9.3％(P＞0.05)，50.6％(P＜0.05)和55.35％(P＜0.01);氧化苦参碱低、中、高剂量组FAS的mRNA水平较高果糖组分别降低15.36％(P＜0.05)，43.67％(P＜0.05)和79.82％(P＜0.01);氧化苦参碱低、中、高剂量组DGAT2的mRNA水平较高果糖组分别降低26.42％(P＜0.05)、56.16％(P＜0.01)和84.74％(P＜0.01);非诺贝特组ACC的mRNA水平较高果糖组降低14.93％，但无统计学差异（P＞0.05）;非诺贝特组FAS和DGAT2的mRNA水平较高果糖组分别降低13.86％和5.48％，无统计学差异（P＞0.05）。　　 3、各组大鼠ACC、FAS和DGAT2的蛋白水平比较:高果糖组大鼠肝脏组织中ACC、FAS和DGAT2的蛋白水平明显高于正常对照组(P＜0.01)，分别升高了245％、311％和436％;氧化苦参碱低、中、高剂量组ACC的蛋白水平较高果糖组分别降低44.08％（P＜0.05），54.69％(P＜0.01)和60.82％(P＜0.01);氧化苦参碱低、中、高剂量组FAS的蛋白水平较高果糖组分别降低21.86％(P＜0.05)，36.66％(P＜0.05)和85.85％(P＜0.01);氧化苦参碱低、中、高剂量组DGAT2的蛋白水平较高果糖组分别降低70.41％（P＜0.01）、81.88％(P＜0.01)和79.13％(P＜0.01);非诺贝特组ACC的蛋白水平较高果糖组升高12.24％，无统计学差异(P＞0.05);非诺贝特组FAS蛋白水平较高果糖组降低5.1％，无统计学差异(P＞0.05)，非诺贝特组DGAT2的蛋白水平较高果糖组降低8.03％，无统计学差异(P＞0.05)。　　 结论:　　 1、高果糖饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠肝脏中的脂质从头合成途径的关键酶的活性、基因和蛋白表达水平明显高于正常对照组，表明高果糖饮食可促进脂质从头合成。　　 2、氧化苦参碱低、中、高剂量组能不同程度地降低脂质从头合成途径中关键酶FAS的酶活性，并降低该代谢通路中的关键酶的基因和蛋白表达水平，提示氧化苦参碱可抑制脂质从头合成。非诺贝特对脂质从头合成途径的关键酶的活性、基因和蛋白表达水平无明显影响，表明非诺贝特抑制肝脂沉积的作用与抑制脂质从头合成途径无关。　　 第三部分氧化苦参碱对脂代谢通路中脂酸氧化途径关键酶的影响。　　 目的:　　 1、探讨氧化苦参碱对脂酸氧化的主要场所线粒体的超微结构的影响。　　 2、探讨氧化苦参碱对脂酸氧化途径关键酶CPT1A酶活性的影响。　　 3、探讨氧化苦参碱对脂酸氧化途径关键酶CPT1A基因表达水平的影响。　　 4、探讨氧化苦参碱对脂酸氧化途径关键酶CPT1A蛋白表达水平的影响。　　 方法:　　 动物分组、标本采集、统计方法同第一部分。每组随机选取2只大鼠留取肝脏的电镜标本以透射电镜观察各组大鼠肝细胞内线粒体的超微结构变化;CPT1A酶活性测定依据文献;CPT1A的mRNA表达水平检测采用实时荧光定量PCR技术;CPT1A蛋白表达水平分析采用Western blot技术。　　 结果:　　 1、各组大鼠肝脏组织透射电镜观察结果比较:透射电镜显示，正常组大鼠肝细胞线粒体形态正常、内外膜完整清晰、嵴排列规则，胞浆内无脂滴及脱颗粒现象;高果糖组大鼠肝细胞线粒体部分出现肿胀、嵴变紊乱甚至缺失，胞浆内有大小不一的脂滴积聚，粗面内质网出现颗粒融合和脱颗粒现象，部分双层核膜融合，核周隙消失，氧化苦参碱中剂量组可见肝细胞内线粒体明显增多、膜完整、嵴部分融合消失，粗面内质网脱颗粒明显、轻度排列紊乱，脂滴散在，但数目较高果糖组明显减少;非诺贝特治疗组可见线粒体增生、嵴排列尚清晰但部分肿胀，表现为基质内的亮区，粗面内质网排列紊乱，胞间连接清晰可见，肝细胞内可见大小不一的脂滴存在。　　 2、各组大鼠CPT1A酶活性比较:高果糖组大鼠肝脏中CPT1A酶活性明显低于正常对照组，降低了51.38％(P＜0.05);氧化苦参碱低、中、高剂量组的CPT1A酶活性较高果糖组分别升高25.55％(P＞0.05)，85.48％(P＜0.05)和74.76％(P＜0.05);非诺贝特组CPT1A酶活性较高果糖组升高147.95％(P＜0.01)。　　 3、各组大鼠CPT1A的mRNA表达水平比较:高果糖组大鼠肝脏中CPT1A的mRNA表达水平明显低于正常对照组，降低了50％(P＜0.05);氧化苦参碱低、中、高剂量组的CPT1A的mRNA表达水平较高果糖组分别升高78％(P＜0.05)，208％(P＜0.01)和215％(P＜0.01);非诺贝特组CPT1A的mRNA表达水平较高果糖组升高260％(P＜0.01)。　　 4各组大鼠CPT1A的蛋白表达水平比较:高果糖组大鼠肝脏中CPT1A的蛋白表达水平明显低于正常对照组，降低了60％（P＜0.05）;氧化苦参碱低、中、高剂量组的CPT1A的蛋白表达水平较高果糖组分别升高117.5％(P＜0.05)，322.5％(P＜0.01)和342.5％(P＜0.01);非诺贝特组CPT1A的蛋白表达水平较高果糖组升高了407.5％(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、高果糖饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠肝脏中的线粒体结构受到损害;氧化苦参碱和非诺贝特能有效改善线粒体结构异常。　　 2、高果糖饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠肝脏中的脂酸氧化途径关键酶CPT1A的酶活性、基因和蛋白表达水平明显低于正常对照组，提示肝脏中脂酸氧化减弱。　　 3、氧化苦参碱低、中、高剂量组和非诺贝特组能不同程度地增加脂酸氧化途径关键酶CPT1A基因和蛋白表达水平，提高酶活性，促进脂酸氧化。　　 第四部分氧化苦参碱对调控脂质代谢通路上游转录因子SREBP-1c和PPARα的影响。　　 目的:　　 1、探讨氧化苦参碱对调控脂质从头合成途径的上游转录因子SREBP-1基因表达水平的影响。　　 2、探讨氧化苦参碱对调控脂酸氧化途径的上游转录因子PPARα基因表达水平的影响。　　 方法:　　 动物分组、标本采集、统计方法同第一部分。肝组织的SREBP-1c和PPARα的mRNA表达水平检测采用实时荧光定量PCR技术检测。　　 结果:　　 1、各组大鼠SREBP-1c的mRNA表达水平比较:高果糖组大鼠肝脏中SREBP-1c的mRNA表达水平明显高于正常对照组，升高了294％（P＜0.01）;氧化苦参碱低、中、高剂量组的SREBP-1c的mRNA表达水平较高果糖组分别降低30.27％(P＜0.05)，63.95％(P＜0.01)和74.15％(P＜0.01);非诺贝特组SREBP-1c的mRNA表达水平较高果糖组升高7.14％，无统计学差异（P＞0.05）。　　 2、各组大鼠PPARα的mRNA表达水平比较:高果糖组大鼠肝脏中PPARα的mRNA表达水平明显低于正常对照组，降低了60％(P＜0.05);氧化苦参碱低、中、高剂量组的PPARα的mRNA表达水平较高果糖组分别升高257.5％(P＜0.05)，300％(P＜0.05)和327.5％(P＜0.01);非诺贝特组PPARα的mRNA表达水平较高果糖组升高612.5％(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、高果糖饮食可诱导大鼠肝脏组织中调控脂质从头合成途径的转录因子SREBP-1c的基因表达水平上调、同时抑制了调控脂酸氧化途径的转录因子PPARα的基因表达。　　 2、氧化苦参碱各剂量组可显著抑制SREBP-1c的基因表达和激活PPARα的基因表达，但非诺贝特组仅能激活PPARα的基因表达，对高果糖诱导的SREBP-1c的基因表达上调无明显抑制作用。