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肾性贫血不仅影响着患者的生活质量,还是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者并发心血管疾病的独立危险因素,可加速CKD进展,增加患者住院率和死亡率。现有标准治疗方案红细胞生成刺激剂（Erythropoiesis stimulating agents,ESAs）+铁剂,因其使用时产生超高的血浆促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）水平会诱发高血压、心衰、中风和心梗等心血管不良反应以及这些不良反应导致的死亡率增加;加之,ESAs需要注射治疗、价格昂贵等因素,主要的治疗人群为即将透析的CKD患者和已经透析的肾衰竭患者,CKD 5期前进行ESAs治疗的患者极少。因此,肾性贫血仍有较大的临床需求未被满足。低氧诱导因子-脯氨酰羟化酶（Hypoxia inducible factor-Prolyl hydroxylase domain,HIF-PHD）抑制剂通过多种效应促进红细胞生成,包括促进内源性EPO生成、改善铁代谢和提高造血细胞对EPO的反应性等,降低了治疗肾性贫血所需的EPO水平,可避免高EPO浓度导致的心血管不良反应。此外,HIF-PHD抑制剂是小分子口服药物,服用方便、费用低,依从性好,能更广泛应用于CKD 3-4期的贫血患者。已有的试验结果也显示其有较好的治疗效果和安全性,有望能克服现有治疗方案的不足,替代现有治疗方案。目的:本课题通过建立成熟稳定的药效筛选体系,包括细胞及动物的体内外实验平台,进行HIF-PHD抑制剂临床前药效研究,筛选出在体外活性及体内药效与参比化合物Roxadutat（又名FG-4592）相当或更优的HIF-PHD抑制剂。结合药代动力学和毒理初步评价,以及化学方面的考量,确定一个候选化合物,然后对候选化合物进行全面的体内外药效学验证。内容:本课题主要包括两部分内容:第一部分是HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。在本部分内容中,首先建立化合物对Hep 3B细胞EPO分泌影响实验,对合成的全新化合物进行细胞活性筛选,筛选出EPO分泌活性、细胞毒性及化合物溶解性达标的化合物进行大鼠药物代谢动力学（Pharmacokinetics,PK）评价;然后将PK参数达标的化合物在ICR小鼠中单次给药后,测试血浆EPO浓度变化,考察体内药理活性;最后对体内活性较好的化合物,结合化学方面的考量,选择部分化合物进行大鼠、犬14或28天毒理评价,筛选出候选化合物。第二部分是候选化合物DS015的体内外药效学验证。在本部分内容中,分别从体外和体内两个方面对DS015进行药效学评价。体外实验包括DS015对HIF-PHD酶的亲和力测试,对Hep 3B细胞EPO转录及分泌的影响,以及对炎症因子（TNF-α和IL-1β）抑制Hep 3B细胞分泌EPO的影响。体内实验中,分别采用健康食蟹猴和大鼠肾性贫血模型进行考察,在正常食蟹猴中评价了DS015对外周血EPO和红系指标的影响,在肾性贫血模型中,分别采用5/6肾切除、庆大霉素和顺铂诱导大鼠肾性贫血模型考察DS015的治疗作用。结果:第一部分:HIF-PHD抑制剂的体内外筛选评价。通过Hep 3B细胞EPO分泌实验,从27个化合物中筛选出了4个化合物细胞活性较好,这些化合物促进Hep 3B细胞分泌的EPO最大浓度与FG-4592相当或更好,EC50在FG-4592 EC50的3倍以内,且这部分化合物的溶解性较好,对Hep 3B细胞毒性低。再经大鼠PK测试后,化合物DS015的PK参数相对较好,其大鼠口服5 mg/kg剂量后Cmax（峰浓度）为18400 ng/m L,AUClast（0-?时刻药时曲线下面积）为38400 h*ng/m L,生物利用度（F）为81.47%,半衰期(T1/2)为4.2 h;表观分布容积(Vss)为0.234 L/kg,不倾向于分布到组织中。之后测试DS015对ICR小鼠体内EPO分泌的影响,其在36、120、360μmol/kg剂量下小鼠血浆EPO浓度为202.34±56.64、581.14±128.39、5249.80±1045.02 pg/m L（溶媒组血浆EPO为153.23±18.31 pg/m L）,有较好的剂量依赖性,与同剂量下FG-4592的EPO水平（324.43～10071.30 pg/m L）相近。另外,还对DS015进行大鼠、犬毒理考察,经过毒理试验初步评价,DS015与参比化合物FG-4592毒性表现相近,DS015大鼠28天毒理试验无明显毒性反应剂量（No Observed Adverse Effect Level,NOAEL）为25 mg/kg,FG-4592大鼠14天毒理试验NOAEL为15 mg/kg;犬14天毒理试验发现,DS015 75mg/kg剂量下毒性明显比FG-4592 50mg/kg剂量轻,最终确定将DS015作为候选化合物开展后续的药效学验证。第二部分:化合物DS015的体内外药效学验证。体外HIF-PHD酶活性测试表明,DS015在HIF-PHD1/2/3酶三个亚型上均有较强的抑制活性,对应的IC50值分别为0.11、0.42、0.043μΜ,活性略优于FG-4592,在三个酶上的选择性与FG-4592相似。在Hep 3B细胞EPO转录及分泌活性实验中,DS015可浓度依赖性的促进EPO转录和分泌,起效浓度为0.93μΜ,活性略优于FG-4592;同样在化合物对炎症因子抑制Hep 3B细胞EPO分泌影响实验中,DS015能逆转炎症因子对EPO分泌的抑制作用,起效浓度为0.93μΜ,且活性略优于FG-4592。体内实验也证实,DS015在健康动物和肾性贫血模型中均表现出较好的药效活性。健康食蟹猴中,单次给予DS015（30～60mg/kg）,可明显升高血浆EPO水平,连续给予DS015（20～80 mg/kg）四周后,可观察到外周血红系指标剂量依赖性地身高,起效剂量为20 mg/kg。大鼠肾性贫血模型的药效研究也表明,在5/6肾切除大鼠贫血模型中,DS015（8～16 mg/kg）每天给药一次,连续给药四周,可以剂量依赖性地改善模型大鼠的贫血症状,起效剂量为8mg/kg;在庆大霉素诱导大鼠贫血模型中,DS015（5～12 mg/kg）每天给药一次,连续给药两周,12mg/kg剂量下,可明显升高模型动物血红蛋白（HGB）水平;在顺铂诱导大鼠肾性贫血中,DS015（8～20 mg/kg）每周给药3次,连续给药四周,可剂量依赖性显著改善模型大鼠贫血症状,起效剂量为8 mg/kg。结论:本课题针对HIF-PHD靶点机制及肾性贫血适应症建立了一系列的体内外药效评价方法。首先通过体内外EPO活性测试、药代动力学评价和毒理试验从27个化合物中筛选出了候选化合物DS015。然后对DS015进行全面的体内外药效学验证,体外酶学和细胞活性上,DS015活性略优于FG-4592,体内肾性贫血模型治疗实验表明,DS015每天给药1次和每周给药3次均可达到较好的治疗效果,起效剂量为8 mg/kg,具有较好的开发潜力。