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基因治疗的兴起为人类彻底克服恶性肿瘤等疾病带来了新的希望，但现有的肿瘤基因治疗方案多存在治疗效率低、特异性不强等问题。细胞凋亡是机体细胞在生长发育中或病理状态下存在的一种自发的程序化的死亡过程。半胱天冬酶（caspase）的切割活化是不同细胞凋亡途径中共同的下游事件。Caspase在细胞中以酶原形式存在，活化后作用于多种蛋白质底物，引起细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡最重要的执行分子之一，它的活化可以高效地不可逆地诱导细胞凋亡，活性caspase-3特异性地作用于肿瘤细胞，将有助于提供一种高效低毒的肿瘤基因治疗新途径。 研究表明，将caspase-3的大小亚基颠倒可以得到具有天然活性的caspase分子（revcasp-3），我们在这种revcasp-3的N端融合来源于绿脓杆菌外毒素（Pseudomonas exotoxin A，PE）转膜结构域的部分序列（253-412或253-364位氨基酸），构建了4种caspase-3融合蛋白（Fcasp-3），其中2种在PE序列和revcasp-3之间加有caspase-3识别并可能切割的氨基酸序列（IETD），在此基础上，进一步构建了PE 253-279位氨基酸截短的融合蛋白，称为“重构型caspase-3”（Rcasp-3）。4种重构型caspase-3瞬时表达于人宫颈癌HeLa等细胞中，倒置显微镜和荧光显微镜观察发现，转染细胞生活力下降，大多数细胞发生死亡，Western blot证实了它们对多聚 贾林涛 第 四 军 医 大学博士学位论文 ADP核糖基化酶（PAny）的切割作用，MH法检测表明，4种 Rcasp上 具有与 revcasp3相似的促进细胞死亡的活性，其中 N端融合 PE aa280上64 的Rcaspl较之融合PE aa 280A 的Rcasp3活性略强，而PE序列和 rCvcasp3之间IETD识别位点的存在对RCCp3活性基本没有影响；建立 了Rcasp－3诱导表达HeLa细胞系，蜕皮素诱导后迅速导致细胞死亡，各 组细胞死亡率大小与瞬时转染MTT检测结果完全一致。测定不含IETD 的Rcasp3诱导表达后的细胞周期，发现它们在诱导后24h均出现凋亡峰， 同时细胞在电镜下呈现膜出泡、染色质固缩、凋亡小体形成等典型的凋亡 细胞的特征。这些结果表明，重构型caspase上均能有效地诱导肿瘤细胞 凋亡，N端外源肽段的存在对revcasp3的促凋亡活性影响不大，而IETD 识别位点对revcasp3活性的影响更是可以忽略。 进一步将抗肿瘤特异性抗原HERZ单链抗体e23sFv、PE转膜结构域 和revc卿〕的基因连接，并在了端连有前导肽基因，构建了Ernmunocasp3 基因，该基因转化人淋巴瘤Jurkat细胞，细胞计数显示转化细胞具有正常 的生长曲线，RT－PCR 和ELISA 证实它们可以通过分泌途径产生 inununocasn3融合蛋白，后者可以特异性地识别HERZ阳性肿瘤细胞，并 转位至细胞浆中，在 PE Arg279和 Gly280间发生断裂，释放出业己被证 明具有自发活性的重构型c卿ase上，高效地诱导细胞凋亡。我们通过体外 共培养实验证实了immunocasp3基因转化的淋巴细胞对HERZ阳性肿瘤 细胞的杀伤作用，DNA梯状电泳条带实验证实这种杀伤是基子内化进入 肿瘤细胞的irnmunocasp3蛋白的促凋亡作用。 由于被irnmtinocasp3基因修饰的淋巳细胞本身功能正常，回输这种 细胞将可以持续分泌效应蛋白，加之caspase是细胞凋亡的直接执行者， 因此对肿瘤细胞的杀伤作用效率更高；Inununocasp3效应分子通过抗体特 异性地识别肿瘤细胞，同时，二种inununocasp3均在N端融合长的抗体 和PE序列，而且它们之间没有可能发生切割断裂的位点，因而推测融合 蛋白在通过血液转移过程中和进入肿瘤细胞前，由于不能正确折叠而不具 有 CAspAnC3的活性。另外，im侧。”p3主要由人源化抗体和人自身蛋 白构成，不会诱发体内强烈的排异反应，而且细胞发生凋亡时不引起炎症 反应，所以治疗的毒副作用较小。本研究可望为HERZ阳性肿瘤的靶向基 4 贾林涛 第 四 军 医 大学博士学位论文因治疗提供一种新思路。