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基因启动子区和编码区的组蛋白乙酰化与转录激活相关,但是由于hsp70基因诱导转录时其基因上发生核小体缺失,乙酰化调控hsp70基因转录的具体机制还不十分清楚。本文通过RT-PCR,ChIP等实验手段,研究了酵母中组蛋白乙酰化在hsp70基因转录中的作用。首先ChIP实验结果表明无论核小体是否缺失,组蛋白乙酰化对于两种诱导表达的hsp70基因ssa3和ssa4的转录都是必需的。并且我们通过温度敏感实验及RT-PCR实验证明组蛋白乙酰基转移酶Gcn5和Elp3参与了hsp70基因的转录,它们的HAT活性对于其行使功能是必需的,而且它们可以直接结合到hsp70基因上,证明它们对于hsp70基因转录的调控作用是直接的。Gcn5和Elp3通过影响组蛋白H3的乙酰化水平调控ssa3和ssa4基因的转录,同时Gcn5和Elp3还能影响ssa3基因上核小体的完整性。尽管这两种组蛋白乙酰基转移酶在乙酰化组蛋白H3时具有重叠的功能,但是它们通过不同的机制影响hsp70的转录。Gcn5主要被招募到基因的启动子区,它的招募依赖Swi/Snf复合物,它影响HSF的招募及RNA聚合酶Ⅱ在基因启动子区的结合;Elp3则主要被招募到基因的编码区,它影响RNA聚合酶Ⅱ在基因上的延伸,而且它行使功能依赖于组蛋白甲基转移酶Set2。我们在TSA处理的野生型菌株和组蛋白去乙酰化酶缺失突变菌株中检测hsp70基因的表达情况,证明酵母中六种组蛋白去乙酰化酶都对hsp70基因的表达具有不同程度的调控功能。我们选择了Rpd3进行进一步的研究,实验结果表明Rpd3以Set2依赖的方式被招募到hsp70基因的编码区,通过使组蛋白H3去乙酰化来抑制hsp70基因转录的进行。我们的研究揭示了组蛋白乙酰化对hsp70基因转录的影响,为更全面的揭示组蛋白乙酰化调控基因转录的机制提供了新的实验证据,同时有助于更好的阐述hsp70基因转录调控的机制。
另一方面人的Elongator复合物在组成及与RNA聚合酶Ⅱ的作用方式上与酵母的Elongator复合物十分相似。在以前的研究中,我们利用酵母的功能补偿系统证实了人Elongator复合物中的hElp3亚基具有和酵母Elp3类似的功能,但对其在哺乳动物细胞中的功能了解较少。为了探索在哺乳动物细胞中hElp3在调控基因转录中的作用,我们用help3反义寡脱氧核苷酸片段处理293T细胞,实验结果表明help3表达的下调明显抑制了hsp70-2基因的表达,同时这一现象伴随着hsp70-2基因上组蛋白H3的乙酰化不足和RNA聚合酶Ⅱ密度降低。而且我们通过ChIP实验检测到hElp3可以被招募到hsp 70-2基因上,进一步证明hElp3对于hsp 70-2基因转录的调控作用是直接的。本文提供了hElp3在人细胞中调控hsp 70-2基因转录延伸的直接证据,为进一步揭示人Elongator复合物的功能及作用机制提供了实验证据。总之,可逆的组蛋白乙酰化修饰对hsp 70基因的转录调控具有十分重要的作用。组蛋白乙酰基转移酶Gcn5和E1p3直接参与了hsp 70基因的转录调控,它们与组蛋白去乙酰化酶的拮抗作用决定了hsp 70基因的转录状态。本论文对热休克基因hsp 70转录调控的研究,为进一步深入探讨其转录机理提供了有价值的实验证据。