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目的:双特异性配体(包括双特异性抗体)在肿瘤免疫治疗领域具有重要的应用前景,其主要作用机制是通过同时与肿瘤细胞和免疫细胞表面的受体结合,促进免疫细胞在肿瘤细胞周边富集,从而增强对肿瘤细胞的免疫杀伤。MUC1高表达于几乎所有的腺癌细胞,包括肺癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌等,是一种具有重大应用潜能的肿瘤治疗靶标。CD16主要表达于NK细胞表面,此外还表达于γδ-T细胞、单核细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞。核酸适配体是一类人工筛选的新型配体分子,由含有特定序列的单链DNA或RNA分子构成,能形成复杂的三维空间结构,以较高的亲和力和特异性与目标配体相结合。本课题计划构建由MUC1核酸适配体和CD16核酸适配体组成的全新分子,评估该分子与MUC1阳性肿瘤细胞及NK细胞的结合能力,并研究该分子能否将NK细胞募集至表达MUC1的肿瘤细胞附近,以及能否增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:通过重叠PCR的方法,将MUC1核酸适配体和CD 16核酸适配体整合为一个分子结构;并再次通过重叠PCR将两个分子拼接,形成双价的双特异性核酸适配体(Bivalent bispecific aptamer,BBiApt)。对所构建的BBiApt的生物学功能进行研究:应用流式细胞术评估BBiApt与靶细胞的结合能力,并与单价核酸适配体的亲合力进行比较;应用流式竞争实验检测双价与单价适配体的结合位点是否相同;通过胰酶消化实验研究BBiApt的结合位点是否位于细胞膜表面;通过活细胞募集实验观察BBiApt能否将NK细胞募集在MUC1阳性肿瘤细胞周围;通过免疫杀伤实验评估BBiApt能否靶向性地增强NK细胞对MUC1阳性肿瘤细胞的杀伤。结果:本课题构建了国际上首个针对MUC1和CD16的双价双特异性核酸适配体(BBiApt)。该分子包含两个MUC1核酸适配体和两个CD16核酸适配体,适配体间用60个碱基长的单链DNA连接。流式实验显示,BBiApt对MUC1阳性肿瘤细胞和CD16阳性免疫细胞的亲合力均显著高于相应的单价适配体,且不结合MUC1阴性的对照细胞。竞争实验显示,当BBiApt和单价适配体与靶细胞共同孵育时,单价适配体的结合能力显著下降,提示BBiApt在靶细胞上的结合位点可能与单价适配体相同。胰酶消化实验显示,BBiApt不能与胰酶消化后的靶细胞结合,提示BBiApt结合了靶细胞表面的膜蛋白。此外,活细胞募集实验显示,BBiApt能够在MUC1阳性肿瘤细胞周围募集更多的NK细胞,而MUC1阴性细胞组中未观察到此现象。NK杀伤实验显示,BBiApt显著增强了 NK细胞对MUC1阳性肿瘤细胞的杀伤功能,但不能增强NK细胞对MUC1阴性肿瘤细胞的杀伤。此外,MUC1适配体单体或CD16适配体单体均未能增强NK细胞对靶细胞的杀伤。结论:本课题所构建的新型双特异性核酸适配体BBiApt,既能与MUC1 阳性肿瘤细胞结合,又能与CD16阳性免疫细胞结合,且能够将NK细胞募集至肿瘤细胞周围,增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。该结果提示,BBiApt在针对MUC1阳性腺癌的免疫治疗中,具有一定的潜在应用价值。