论文部分内容阅读
朊病毒病又称可传播性海绵状脑病（TSE），是一类罕见的致死性神经退行性疾病。在人类中主要包括克-雅病（Creutzfeldt-Jakob disease,CJD）、库鲁病（Kuru）、致死性家族 型 失 眠 症 （ Fatal familial insomnia,FFI ）、 吉 斯 特 曼 斯 特 劳 斯 综 合 症（Gerstmann-Straussler-Scheinker,GSS）等，在动物中主要包括牛的海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathies,BSE）和羊瘙痒病（Scrapie）等。朊病毒病的临床表现为进行性共济失调、震颤、认知障碍，最终导致死亡，其病理特征为中枢神经系统出现海绵状变性、淀粉样斑块、神经元丢失以及星形胶质细胞增生等。目前该病较普遍认同的机制为正常构象的朊蛋白（PrPC）错误折叠，转变为异常朊蛋白（PrPSc），产生神经毒性，在中枢神经系统中积累并最终导致神经元细胞死亡。 堤岸田鼠对很多种属的朊病毒易感。我们比较发现在堤岸田鼠的朊蛋白氨基酸序列中，只有两个位点是同仓鼠和小鼠都不相同的，分别是位于C端的227和230位。为了评估这两个位点对堤岸田鼠RT-QuIC反应的影响，我们构建了堤岸田鼠野生型（Vole-WT），两种突变型（Vole-E227D，Vole-S230R），以及仓鼠野生型（Ha-WT）蛋白用于RT-QuIC反应。菌液在TB培养液中诱导表达，使用盐酸胍对蛋白进行变性，变性液与镍混合放入层析柱中进行蛋白复性并洗脱纯化。RT-QuIC使用黑色96孔底读板，反应及荧光值读取在BMG FLUOstar多功能酶标仪中进行。我们使用ExPASy网站对Vole-WT，Vole-E227D， Vole-S230R和Ha-WT四种蛋白的等电点和亲水性进行分析。 结果显示堤岸田鼠野生型及两种突变型具有极强的RT-QuIC反应效率。即使在较弱的反应条件下，田鼠野生型及突变型也表现出比仓鼠更高的反应效率。其中Vole-E227D在三种田鼠蛋白中是效率最高的，随后为野生型和Vole-S230R。 我们的结果表明堤岸田鼠朊蛋白氨基酸227位和230位不是造成堤岸田鼠RT-QuIC反应如此高的原因，但特定氨基酸位点的改变会在一定程度上影响朊蛋白的RT-QuIC反应效率。该结果还表明Vole的PrP蛋白在RT-QuIC中具有较强的纤维化倾向，甚至会自发发生纤维化，这种特性可能是堤岸田鼠对众多毒株易感的原因，但同时也会影响Vole蛋白在今后的CJD疾病诊断中的应用。