G-蛋白偶联受体（G Protein-coupled Receptor, GPCR）属于一类已知的最大且广泛存在的七次跨膜受体家族,并参与转导一系列细胞外信号,如光子、气味分子、肽类、生物胺、蛋白酶、信息素、荷尔蒙、核苷酸、以及脂类等等,通过G蛋白激活下游效应器以产生细胞内如环腺苷酸（cyclic AMP,cAMP）、肌醇-1,4,5-三磷酸（inositol1,4,5-trisphosphate, IP3）或钙离子等第二信使,从而引起各种生物学或生理学的功能变化。有些GPCR的天然配体还没有被发现,这类GPCR被称为为孤儿受体（orphan GPCR, oGPCR）。GPR12,GPR3以及GPR6同属于一种具备构建性活性（constitutive activity）的oGPCR家族,即在无配体存在情况下其表达可直接激活下游效应器从而引起各种生理学变化。神经鞘氨醇磷酸胆碱（sphingosylphosphorylcholine, SPC）已被证实可高亲和力激活GPR12引发多种生理学功能变化,如细胞增殖,神经轴突延伸,细胞成簇,或维持减数分裂阻滞等等。然而GPR12的具体功能及其所介导的信号通路与机制尚未明了。我们的研究发现,在非神经细胞系人胚胎肾细胞（Human Embryonic Kidney293,HEK293）中异源表达GPR12可以引起细胞的增殖与促进存活,而在神经细胞系大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma12,PC12）中过表达GPR12则会促进细胞胞体增大、突触生长与延伸,从而导致细胞往神经元方向的定向分化。通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术（fluorescence real-time polymerase chain reaction, real-time Q-PCR）, RNA干扰技术（RNAinterference, RNAi）,免疫组织化学,Western blotting以及细胞内cAMP浓度检测等多种研究手段从形态学、mRNA水平和蛋白水平对GPR12在细胞增殖、存活与分化等多方面的作用及其可能的相关机制进行了初步探讨。1.重组人GPR12表达载体的构建与功能性表达的鉴定我们运用PCR技术等分子生物学手段成功克隆与构建了人GPR12表达载体,并通过细胞转染技术,使非神经性细胞系中国仓鼠卵巢细胞（Chinese HamsterOvary, CHO）异源性高表达GPR12。运用实时荧光定量PCR技术,Western blotting以及细胞内cAMP水平浓度测定等多种检测手段对人GPR12表达载体进行表达与功能的鉴定。结果显示,稳定转染了人GPR12表达载体的CHO单克隆细胞可在mRNA与蛋白水平上高表达GPR12,并将直接引起细胞内cAMP水平的增高。已有文献报道,鞘氨醇磷酸酯（Sphingosine-1-phosphate, S1p）可通过与GPR12家族成员的相互作用激活下游Gs蛋白引起细胞内cAMP水平的增加。较之S1p,SPC可以更高亲和力的激活GPR12。通过对细胞内cAMP检测发现,10μM SPC相较于同样浓度的S1p,可以显著性提高细胞内cAMP浓度,从另一个角度验证了重组人GPR12表达载体在细胞中的功能性表达。2.GPR12可能参与促进HEK293细胞的增殖与存活首先异源性过表达人GPR12表达载体以验证其在HEK293中功能性表达。通过MTT比色法以及Alamar Blue测定法分别从光密度值（optical density value, O.D value）与相对荧光量（relative fluorescence unit, RFU）检测GPR12对细胞活性与增殖的影响。结果表明,高表达GPR12可提高HEK293细胞的活性并促进细胞增殖。Ki67是一种检测处于增殖状态细胞的常用分子标记。免疫组化结果表明,在细胞增殖过程中,表达Ki67的细胞比例以一种时间依赖的方式递增；其中,高表达GPR12的细胞组中表达Ki67细胞比例要明显高于对照组,从而进一步验证了GPR12对细胞增殖的促进作用。对细胞施加某种特殊压力可诱导细胞发生凋亡。对稳定表达GPR12与空载体（Vector）的HEK293细胞分别进行血清剥夺,并通过MTT和Alamar Blue实验检测细胞活性,我们发现高表达GPR12可以提高细胞压力耐受,从而促进细胞的压力存活。为了进一步验证GPR12在调控细胞凋亡中的作用,我们运用流式细胞术（flow cytometry, FCM）结合FITC-Annexin Ⅴ/碘化并啶（Propidium Iodide,PI）双染法检测细胞的凋亡水平。处于凋亡早期的细胞可被FITC-Annexin Ⅴ染色,而处于凋亡晚期的细胞则易被PI染色。研究发现,血清剥夺可诱导细胞出现明显凋亡；但过表达GPR12细胞组的细胞存活比率高于对照组,同时发生凋亡的比例则明显低于对照组。这表明高表达GPR12可促进细胞的存活,提示了GPR12可能是调控细胞凋亡中的关键因子。3.过表达GPR12介导下游信号通路的分子机制初探丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）是介导细胞反应的重要信号通路,参与调节细胞增殖、有丝分裂、迁移、凋亡、存活以及细胞间相互作用等多种生理反应。胞外信号调节激酶（extracellular relative kinase, erk）信号通路是最早发现的经典MAPK信号转导途径,在促进细胞增殖与存活上扮演了重要角色。B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma2, Bcl-2）被认为是抑制细胞凋亡的关键因素之一。已有研究表明,Bcl-2可以直接参与Erk信号通路的激活；同时Erk1/2也可以增强Bcl-2的磷酸化或者促进其表达水平的提高。Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein, Bax）是Bcl-2家族成员之一,通过形成Bax/Bax二聚体来促进细胞凋亡。一旦Bcl-2与之竞争性结合,可以有效的抑制Bax/Bax二聚体的产生,缓解细胞的凋亡水平,从而达到促进存活的目的。通过Western Blotting从增殖时间与表达浓度上分别检测Erk1/2的磷酸化水平变化发现,过表达GPR12可以一种浓度依赖的方式增强Erk1/2的瞬时磷酸化水平,从而激活erk信号级联反应。这个结果提示了Erk1/2信号通路可能参与了GPR12所介导的细胞增殖与存活。与此同时,通过质粒过表达与RNA干扰技术,从正反两个方向对GRP12与促进存活的关键靶点Bcl-2之间的表达变化关系。结果表明,GPR12的过表达可促使Bcl-2与Bax的表达同时呈现出相反方向的梯度变化；当GPR12的表达被RNA干扰技术特异性下调时,Bcl-2与Bax的表达也相应发生调整。这更进一步解释了GPR12可能参与促进细胞的压力存活。此外,GPR12也可以直接影响总Erk1/2（tErk1/2）的表达水平。GPR12浓度梯度的递增表达可以提高tErk1/2的表达水平；利用RNA干扰下调GPR12的表达,tErk1/2的表达水平也随之降低。tErk1/2的表达水平变化往往与某些生理或心理疾病相关,这意味着GPR12可能是研究治疗此类病症的潜在靶点之一。4.GPR12过表达可促进PC12细胞神经元方向的分化早期研究表明,GPR12在神经瘤母细胞Neuro2a中的过表达,可以引起Neruo2a细胞的形态学变化,引起神经突发生。而通过加入GPR12的高亲和力配体SPC,可以浓度依赖的方式诱导PC12细胞的类神经元分化,这意味着过表达GPR12有可能会促使PC12细胞往神经元方向分化。通过将人GPR12表达载体在PC12细胞中的过表达,我们发现PC12细胞出现明显的轴突生长与延长；同时稳定过表达GPR12的细胞胞体直径表现出显著性增加。TuJ1和MAP-2都是神经元分子标记,前者是早期神经元分子标记,后者则是成熟神经元分子标记。细胞免疫组织化学结果表明,PC12细胞的核周体可呈现TuJ1与MAP-2双阳性。稳定表达GPR12的细胞组,无论细胞球团还是单细胞,较之对照组在胞体与神经突起上都表现出TuJ1与MAP-2的较强表达,从而进一步验证了过表达GPR12可诱导PC12细胞定向分化为类神经元细胞。5.GPR12诱导PC12细胞分化的分子机制初探已有报道表明,GPR12家族成员具备促使神经元轴突延伸的作用,其中在大鼠小脑颗粒神经元中过表达GPR12可引起的轴突延伸最为明显；SPC的已知受体有三种,包括OGR1、GPR4与GPR12。在E15d大鼠大脑皮层神经元中,仅存在GPR12的表达。通过SPC处理后,神经元的突触接触密集度增加,并显著性增强突触素蛋白（Synaptiphysin, SYP）的表达。我们通过运用实时定量PCR技术,Western Blotting,以及细胞免疫组织化学对过表达GPR12的PC12细胞进行检测,发现PC12细胞中存在GPR12的内源性表达；且GPR12的过表达在mRNA与蛋白水平上都能显著性提高SYP的表达。GPR12与SYP在分化的PC12细胞的核周体与轴突上也存在明显的共表达,这说明GPR12很可能在轴突形成与神经元可塑性上扮演着重要的角色。此外,Bcl-2及其家族成员Bcl-xL,不仅仅参与调控细胞的凋亡与存活,在促进突触延伸、维持神经元存活与调节神经元突触可塑性上起着不可忽视的作用。有研究表明,在海马神经元中过表达Bcl-xL可以上调SYP的表达并促进神经元突触的形成。在本实验中通过免疫印记技术,我们发现过表达GPR12可以激活Erk信号通路,同时可以显著性提高Bcl-2与Bcl-xL的表达水平,这意味着GPR12可能通过激活Erk1/2信号通路,调控Bcl-2、Bcl-xL与SYP的表达,进而达到促进PC12往神经元方向定向分化的目的。