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研究背景:近年来,随着世界人口老龄化趋势的日益加速,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)已经成为了全球性的、不容忽视的公共健康问题。资料显示,在中国人口的社会老龄化进程日益提速的背景下,阿茨海默病患病率呈明显上升趋势,预计到2050年,我国老年痴呆症患者人数将达到2700万。如何通过防治阿尔茨海默病来提高老年人晚年生活质量,减轻社会负担成为科学研究的焦点问题。因此,探究阿尔茨海默病相关的细胞及分子机制、寻找有效的早期诊断、预后标志物和治疗靶点对诊断阿尔茨海默病及判断预后具有十分重要的作用。富含丙氨酸的豆蔻酰化蛋白激酶C的作用底物(myristoylated alanine-rich C kinase substrate,MARCKS)属于蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的一种特异性底物,在神经系统中高水平表达。它在细胞形态、细胞运动、分泌、跨膜转运、细胞周期调节和神经发育中起着重要作用。MARCKS蛋白以磷酸化和非磷酸化两种不同的形式存在于大脑组织内,在G蛋白偶联受体信号途径中发挥着不可替代的作用。磷酸化后的MARCKS(Phosphorylated myristoylated alanine-rich C kinase substrate,P-MARCKS)易位到细胞质中参与膜运输,细胞运动和神经递质释放等神经功能活动,它定位于AD特征性病理改变-老年斑(senileplaques,SP),可能参与其诱导的神经功能障碍。有研究报道,MARCKS磷酸化可以导致树突棘的形态、数量、密度等发生改变,是触发突触病理状态的起始事件,远早于临床症状出现。P-MARCKS被发现与突触可塑性密切相关使我们推断P-MARCKS可能也与阿尔茨海默病相关,但有关于P-MARCKS对阿尔茨海默病作用的分子机制尚不明了。以上种种证据说明MARCKS磷酸化是阿尔茨海默病发病过程中起到非常重要的作用。因此,本课题计划通过Aβ1-42寡聚体干预乳鼠大脑皮层、海马神经细胞建立AD细胞模型,研究Aβ1-42寡聚体的神经毒性作用,并进一步探索P-MARCKS在AD模型中的表达及相关信号通路,以及其对突触可塑性的影响和潜在的作用机制,阐明P-MARCKS对阿尔茨海默病病变的作用,为进一步阐明阿尔茨海默病发病机制提供新的思路,为临床治疗尝试新的可能方向。方法:1.本实验选用Wsitar大鼠新生24h内的乳鼠,进行大脑皮层、海马神经细胞原代培养的方法。以常见的Aβ1-42寡聚体干预大脑皮层、海马神经细胞为AD细胞模型。2.用CCK-8和HOECHST33258检测Aβ1-42寡聚体干预对细胞活性及细胞凋亡的影响,并应用NMDAR拮抗剂美金刚预处理验证这种神经毒性是否由NMDAR介导。3.用Western Blot检测Aβ1-42寡聚体干预对P-MARCKS蛋白表达的影响,并应用NMDAR拮抗剂美金刚预处理验证该蛋白表达变化是否由NMDAR介导。4.用Western Blot检测Aβ1-42寡聚体干预对突触可塑性关键蛋白PIP2、SYP表达的影响,并应用NMDAR拮抗剂美金刚预处理验证上述蛋白表达改变是否由NMDAR介导。结果:1.CCK8结果显示:各组细胞干预24h后,Aβ1-42处理组的细胞活性与对照组相比降低(P<0.05,图1)。美金刚预处理2h后再行Aβ1-42寡聚体干预,细胞活性与单独Aβ1-42处理组相比升高(P<0.05,图1)。2.各组细胞分别干预3h、24h后进行Hoechst33258染色。单独Aβ1-42寡聚体作用神经元细胞3h后,少量细胞细胞核呈凋亡改变(图2A),与对照组相比,凋亡细胞数占总细胞数的比例增加(P<0.05,图2C);美金刚预处理2h后再行Aβ1-42寡聚体干预,凋亡细胞数减少,凋亡细胞数占总细胞数的比例与Aβ1-42处理组相比降低(P<0.05,图2C)。单独Aβ1-42寡聚体作用神经元细胞24h后,大量细胞细胞核呈现典型的凋亡改变(图2B),与对照组相比,凋亡细胞数占总细胞数的比例增加(P<0.05,图2C);美金刚预处理2h后再行Aβ1-42寡聚体干预,与对照组相比凋亡细胞数减少,凋亡细胞数占总细胞数的比例减少(P<0.05,图2C)。3.单独Aβ1-42寡聚体分别作用神经元细胞3h、24h后,P-MARCKS蛋白表达与正常对照组相比增加(P<0.05,图3);美金刚预处理2h后再行Aβ1-42寡聚体干预与单独Aβ1-42干预相比降低了P-MARCKS蛋白表达(P<0.05,图3)。4.各组细胞干预24h后,单独Aβ1-42寡聚体作用神经元细胞24h后,PIP2蛋白表达增加,SYP蛋白表达降低,差异与对照组相比有统计学意义(PIP2：P<0.05;SYP：P<0.05,图4);美金刚预处理2h后再行Aβ1-42寡聚体干预,PIP2蛋白表达下降,SYP蛋白表达升高,差异与单独Aβ1-42干预组相比有统计学意义(PIP2:P<0.05;SYP：P<0.05,图4)。结论:1.Aβ1-42寡聚体可引起原代神经细胞活力减退,NMDAR拮抗剂美金刚预处理可逆转细胞活性下降趋势,证明Aβ1-42寡聚体的神经毒性作用在一定程度上是由NMDAR介导的。2.Aβ1-42寡聚体可诱导原代神经细胞发生凋亡改变,NMDAR拮抗剂美金刚预处理可降低细胞凋亡率,证明Aβ1-42寡聚体的神经毒性作用在一定程度上是由NMDAR介导的。3.Aβ1-42寡聚体可导致原代神经细胞P-MARCKS表达增加,NMDAR拮抗剂美金刚预处理可缓解该蛋白表达变化,证明P-MARCKS蛋白表达及相关功能在一定程度上是由NMDAR介导的。4.Aβ1-42寡聚体可导致原代神经细胞PIP2表达增加、SYP表达下降,NMDAR拮抗剂美金刚预处理可缓解上述蛋白表达变化,证明Aβ1-42寡聚体所致的突触可塑性改变在一定程度上是由NMDAR介导的。研究意义上述结果建议P-MARCKS在阿尔茨海默病发病过程中发挥关键作用,NMDAR拮抗剂美金刚可缓解Aβ1-42寡聚体介导的神经毒性作用并通过抑制P-MARCKS表达、改变其下游PIP2和SYP表达来缓解Aβ1-42寡聚体导致的突触可塑性下降。