卵巢早衰（premature ovarian failure,POF）是一种临床异质性高的疾病,随着社会经济的快速发展,POF的发病率呈上升趋势。当前POF的治疗方法主要是进行激素补充治疗,这种治疗方法虽然能够缓解患者的各种临床症状,但是对卵巢功能并不能从根本上进行改善,所以如何为POF患者提供一种安全有效的治疗方式成为目前的热点。已有大量研究证实,脂肪干细胞来源的外泌体（ADSCs-EXO）可在多种组织器官的修复中发挥有效作用,但目前关于同种来源的ADSCs-EXO在卵巢早衰中的作用尚无报道。本研究利用大鼠颗粒细胞损伤模型和大鼠卵巢早衰模型,研究ADSCs-EXO对卵巢颗粒细胞和组织的保护作用,并初步探索其作用机制,为POF的治疗提供了一种新的安全有效的途径。第一部分:大鼠脂肪干细胞来源的外泌体的分离与鉴定【目的】采用酶消化法从大鼠腹股沟脂肪提取脂肪干细胞,然后采用快速试剂盒提取法对脂肪干细胞进行外泌体的提取,最后对提取的外泌体特性进行鉴定,验证快速试剂盒提取法的可靠性,为下一步实验细胞和动物实验奠定基础。【材料与方法】切取12周大鼠腹股沟的脂肪组织,使用I型胶原蛋白酶消化法进行脂肪干细胞的提取,将提取的细胞接种于培养瓶中进行培养,首先鉴定其表面标记物,然后检测其成脂、成骨、成软骨的多向分化能力。将稳定传代的第三代ADSCs进行传代并收集细胞上清,然后采用快速试剂盒提取法外泌体,提取后进行电镜检测、粒径分析及表面标志物的Western Blotting测定,完成对脂肪干细胞来源的外泌体（ADSCs-EXO）的鉴定。【结果】1、细胞形态学观察结果显示,细胞生长良好,出典型的鱼群状表现,传代以后,细胞形态稳定,表现为长梭型。2、ADSCs阳性标记物CD90、CD73、CD44均为阳性表达,而阴性标记物CD45、CD34、CD11b均为阴性表达,结果符合脂肪间充质干细胞表面标记物的特点。3、本实验中获得的ADSCs可以成功分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞。4、透射电子显微镜下可见,ADSCs-EXO呈现圆形或椭圆形小囊状两种典型的形态,为脂质双层膜,直径在50-100nm左右。5、粒径分析结果显示ADSCs-EXO直径分布中位数为125.6nm,悬液中原始颗粒浓度为1.2×10⁹个/m L。6、Western Blotting结果显示,特异性膜蛋白CD9、CD63以及膜生成相关复合物TSG101为阳性表达。【结论】采用快速试剂盒法能够从ADSCs从成功分离外泌体,所得的ADSCs-EXO经过鉴定符合外泌体相关检测标准,可以用于后续的实验研究。第二部分:去氧乙烯基环己烯（VCD）诱导大鼠卵巢早衰模型的建立【目的】验证文献报道中的腹腔连续注射VCD诱导SD大鼠卵巢早衰的方式,建立稳定的类似人类卵巢早衰变化过程的动物模型,为后续研究奠定坚实的基础。【材料与方法】选取动情周期正常的1月龄大鼠,随机分成空白组、佐剂组及VCD组进行实验,佐剂组及VCD组每日按照2m L/Kg（0.2m L/100g）进行腹腔连续注射,连续15天,佐剂组注射芝麻油,VCD组注射VCD工作液。给药完成后第1周开始进行动情周期的监测,给药完成后第4周、7周、10周随机抽取3只大鼠进行眼眶血及双侧卵巢的收集。眼眶血采用ELISA的方法进行血清E₂、FSH及AMH水平的测定,卵巢HE染色后观察其形态、结构及卵泡数目的变化。【结果】1、空白组和佐剂组大鼠动情周期规律出现,实验结束时无1只出现动情周期紊乱;而VCD组给药完成后10w所有大鼠均出现发生动情周期紊乱,均造模成功。2、卵巢形态观察及卵泡计数结果显示,空白组、佐剂组整个实验过程中,卵巢无明显变化,各级卵泡数目正常;VCD组给药完成后第10w,卵巢中不同发育阶段的卵泡数目均明显减少,始基卵泡数为20.67±2.52,初级卵泡数为26.00±3.00,次级卵泡数为15.00±1.00和窦状卵泡数为9.33±1.53。3、血清学指标的测定结果显示,空白组、佐剂组各取材时间点血清E₂、FSH及AMH比较无明显变化;VCD组给药完成后第10w,血清E₂及AMH分别降低至29.87±2.54、0.76±0.07明显,而FSH增高为20.79±1.32。【结论】采取连续15天对1月龄大鼠进行腹腔注射VCD（160mg/kg）的建模方式能够成功建立POF模型。第三部分:脂肪干细胞来源的外泌体对VCD损伤大鼠颗粒细胞的作用研究【目的】建立并利用VCD诱导的大鼠颗粒细胞损伤模型,探讨ADSCs-EXO是否对VCD损伤的大鼠颗粒细胞具有修复及保护作用,并初步研究其机制,为下一步动物实验打下基础。【材料与方法】选取四只3-4周龄大鼠,采用胰酶法进行大鼠卵巢颗粒细胞的提取,观察颗粒细胞增殖活力及激素分泌情况。然后将颗粒细胞分为空白组、VCD组及VCD+ADSCs-EXO组（VCD 30μM+ADSCs-EXO 10μg）进行培养48h后,测定各组细胞抑制率、激素分泌情况、细胞凋亡率,然后进一步检测Bcl-2,Bax,Caspase-3,Kitl等相关蛋白的表达情况。【结果】1、胰酶法提取到的大鼠颗粒细胞生长存活率高,生长状态稳定,能够用于后续各项实验的开展。2、VCD+ADSCs-EXO组颗粒细胞增殖抑制率、细胞激素分泌量要明显好于单纯VCD组,抑制程度轻微;Annexin-V/PI双染法结果显示VCD+ADSCs-EXO组存活细胞比例要大于VCD组,而凋亡早期细胞及凋亡晚期细胞比例要小于VCD组。3、荧光定量PCR和Western Blotting实验结果显示VCD+ADSCs-EXO组与VCD组相比较,促进凋亡基因Bax和凋亡蛋白酶Caspase3表达的水平均明显降低,而抑制凋亡基因Bcl-2表达的水平明显增高;VCD+ADSCs-EXO组与VCD组相比较,KITL基因表达水平明显增高。【结论】ADSCs-EXO可以明显改善和抑制VCD损伤颗粒细胞的应激反应和凋亡,对颗粒细胞具有保护作用,其机制可能影响凋亡与抗凋亡相关途径蛋白的表达,实现对颗粒细胞的保护作用。第四部分:脂肪干细胞来源的外泌体对VCD诱导卵巢早衰大鼠的作用研究【目的】通过VCD诱导成功的大鼠卵巢早衰模型,探讨ADSCs-EXO对大鼠卵巢功能是否具有修复及保护作用,并初步研究其作用机制,为POF的治疗提供一种新的有效的方案。【材料与方法】将大鼠分为空白组及建模组,建模成功后分为空白组、PBS组、ADSCs组及EXO组进行手术,其中空白组、PBS组每侧卵巢原位分别注射20μL PBS,ADSCs组每侧卵巢原位注射20μL ADSCs细胞悬液,EXO组每侧卵巢原位注射20μL ADSCs-EXO悬液。术后第1天开始进行动情周期的监测,术后28天后收集各组大鼠眼眶血及卵巢,眼眶血采用ELISA的方法进行血清E₂、FSH及AMH水平的测定,左侧卵巢进行HE染色、卵泡形态计数、Tunel染色及免疫组化,右侧卵巢进行Bcl-2,Bax,Caspase-3,KIT,Kitl,PI3K,AKT等相关蛋白的表达情况。【结果】1、空白组大鼠动情周期规律出现,PBS组大鼠无规律动情周期出现,EXO组与ADSCs组动情周期均逐渐发生恢复,但EXO组恢复的更快,发情期时间占比要优于ADSCs组。2、ADSCs组及EXO组卵巢组织中各级卵泡数目明显增多,但EXO组卵巢的情况要比ADSCs组明显要好。3、ADSCs及ADSCs-EXO卵巢原位注射均可以使VCD卵巢早衰大鼠的血清E₂、AMH及FSH水平恢复,但是ADSCs-EXO血清指标恢复程度要明显优于ADSCs。4、TUNEL结果显示,ADSCs组及EXO组卵泡内外凋亡的细胞明显减少,但凋亡程度EXO组要明显优于ADSCs组。5、免疫组化结果显示,ADSCs与ADSCs-EXO能够有效的使颗粒细胞凋亡基因Bax,Caspase3表达减少,但ADSCs-EXO的作用要优于ADSCs。6、荧光定量PCR和Western Blotting实验结果显示ADSCs组、EXO组与VCD组相比较,Bax和Caspase3基因表达的水平均明显降低;Bcl-2、KIT、Kitl、PI3K、AKT基因表达的水平均明显增高;但是EXO组下降和上升的幅度要明显好于ADSCs组。【结论】ADSCs-EXO对VCD诱导的POF大鼠卵巢功能具有修复和保护作用,其机制可能是因为抑制卵巢颗粒细胞凋亡,进而激活KIT-KITL-PI3K-AKT信号传导通路得以实现的,将ADSCs-EXO用于卵巢早衰治疗,具有良好的临床转化和应用前景,为POF的治疗提供了一种新的有效的方案和思路。