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目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是最常见的慢性代谢性肝脏疾病之一。最新数据显示2018年该病全球患病率超过25.00%。其主要特点是在没有过量饮酒的情况下体内甘油三酯过量蓄积。随着疾病进程,该病可发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝脏肿瘤。此外,NAFLD还与代谢综合征、2型糖尿病、胰岛素抵抗、肥胖、心血管疾病等多种慢性代谢性疾病密切相关,严重危害着人们的健康。近年来,我国环境中金属污染日趋严重,由金属污染导致的机体健康损害效应已经成为环境与健康研究领域的重点。人体接触多种有毒金属、过量或缺乏必需微量元素都会造成健康损伤。流行病学研究提示,人体低铜、铁、硒、镁、锌水平和高砷、钙、镉、铅水平均可能是NAFLD患病风险增加的危险因素。但是,既往的研究主要关注于单一金属暴露的健康损害效应,而环境中金属通常是以复合暴露形式存在,特别是各种金属之间可能会存在相互作用,因此明确多种金属复合暴露对NAFLD的损害效应具有必要性和重要价值。此外,研究还证实NAFLD发病机制与脂质代谢异常引起的活性氧蓄积、过度氧化应激反应和炎症反应等因素密切相关。研究报道人体钡、铬、镉、钼、钒和锌浓度与氧化应激反应呈正相关。另外,补体系统作为人体先天免疫防御的重要组成部分,在抗氧化应激和抗炎症反应过程中发挥着重要作用。人体和动物实验发现,NAFLD在发生发展过程中补体C3和C4被激活,补体C3可促进肝脏中甘油三酯的蓄积,并且补体C3和C4水平与脂肪肝脏损伤程度呈平行关系。但迄今为止,关于金属复合暴露以及补体系统与NAFLD风险关系的研究相对匮乏。因此,本研究拟利用污染物复合暴露模型和孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)分析方法,探讨广西防城港男性健康队列血清22种金属复合暴露、补体C3和C4与NAFLD风险的因果关系,为发现NAFLD患病风险的独立危险因素和寻找NAFLD风险预测生物标记物提供线索,并为进一步阐明NAFLD发生发展机制、明确NAFLD高危个体提供科学依据。方法:第一部分:(1)采用以医院体检人群为基础的横断面研究和纵向研究方法,选取广西防城港男性健康队列2009年基线人群和2013年随访人群作为研究对象。横断面研究共纳入1594人,其中有NAFLD患者330人和非NAFLD研究对象1264人;纵向队列研究共纳入566名基线研究对象,其中有NAFLD新发患者144人和非NAFLD研究对象422人。(2)采用调查问卷收集研究对象的一般人口学特征、既往史、个人史、家族史、饮酒史、吸烟史等。运用腹部超声检查对研究对象进行脂肪肝诊断。采用电感耦合等离子体质谱仪测定血清中22种金属浓度。(3)运用二元Logistic回归分析计算比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI),以及Cox回归分析计算风险比(hazard ratios,HR)及其95%CI。采用秩和检验和LASSO回归分析分别构建多金属复合暴露模型,限制性立方样条回归分析单金属与NAFLD患病风险的剂量反应关系,分层分析亚组金属暴露情况。第二部分:(1)采用与第一部分研究相同的设计原理和研究对象,横断面研究共纳入1600人,其中有NAFLD患者328人和非NAFLD研究对象1272人;纵向队列研究共纳入572名基线研究对象,其中有NAFLD新发患者146人和非NAFLD研究对象426人。(2)采用全自动生化分析仪测定血清中补体C3和C4浓度。(3)运用双向MR分析方法,采用补体C3相关的2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点(rs3753394和rs3745567),补体C4相关的8个SNPs位点(rs1052693、rs11575839、rs2075799、rs2857009、rs2071278、rs3763317、rs9276606和rs241428)和NAFLD相关的7个SNPs位点(rs12137855、rs780094、rs4240624、rs1227756、rs738491、rs738409和rs5764455)分别构建遗传风险评分(genetic risk score,GRS),并将GRS作为工具变量,运用两阶段最小二乘回归法分析补体C3和C4与NAFLD患病风险的因果关系。所有的统计检验均为双侧概率检验,检验水准α=0.05。结果:第一部分:(1)横断面研究中,NAFLD组中年龄以及已婚、受过高等教育、代谢综合征和胰岛素抵抗患病比例均较非NAFLD组高;血清钡、镉、钙、铁、铅、镁、锰、钼、镍、锡、钒和锌元素在两组间的分布有统计学差异(全部P<0.05)。纵向研究中,新发NAFLD组中受过高等教育、代谢综合征和胰岛素抵抗患病比例均较非NAFLD组高;血清钡、铅、锰、钼、钒和锌元素在两组间的分布均有统计学差异(全部P<0.05)。(2)斯皮尔曼等级相关分析显示,血清21种金属间均存在不同程度的相关关系。(3)运用秩和检验筛选出钡、铅、锰、钼、钒和锌6种金属构建多金属模型,而LASSO回归分析方法则筛选出钡、钴、铜、铁、锰、钼、铷、硒、锡、钛、钒和锌12种金属。(4)在六金属模型中,校正年龄、婚姻状况、教育程度、吸烟状况、饮酒状况、代谢综合征和胰岛素抵抗后,横断面研究和纵向研究均只有低血清钼水平和高血清锌浓度增加NAFLD风险(校正OR钼=0.41,95%CI:0.26,0.65;校正OR锌=3.60,95%CI:2.24,5.79;校正HR钼=0.51,95%CI:0.31,0.84;校正HR锌=2.02,95%CI:1.16,3.53;全部Ptrend<0.05)(Quartile 4相对Quartile 1)。十二金属模型分析也显示同样的结果(校正OR钼=0.50,95%CI:0.31,0.81;校正OR锌=4.46,95%CI:2.69,7.40;校正HR钼=0.47,95%CI:0.27,0.80;校正HR锌=2.15,95%CI:1.19,3.87;全部Ptrend<0.05)。(5)横断面研究和纵向研究分析血清钼和锌的联合作用,结果显示每增加一个标准差金属评分亦增加NAFLD风险(原始OR=1.64,95%CI:1.46,1.85;校正OR=1.50,95%CI:1.30,1.72;原始HR=1.28,95%CI:1.10,1.48;校正HR=1.17,95%CI:1.00,1.36;全部Ptrend<0.05)。(6)剂量反应关系分析显示,血清钼水平与NAFLD风险呈U型关系(P总体=0.023,P非线性=0.043),而血清锌水平与NAFLD风险呈线性关系(P总体<0.001,P非线性=0.467)。(7)分别采用年龄、婚姻状况、吸烟状况、饮酒状况、代谢综合征和胰岛素抵抗进行分层,分层分析结果显示血清钼和锌浓度与NAFLD风险关系不相一致。第二部分:(1)横断面研究中,NAFLD组中年龄以及已婚、受过高等教育、代谢综合征和胰岛素抵抗患病比例均较非NAFLD组高;NAFLD组血清补体C3和C4中位数浓度(分别为1.29 g/L和0.35 g/L)均高于非NAFLD组(分别为1.08 g/L和0.32 g/L),两组间的分布均有统计学差异(全部P<0.001)。纵向研究中,新发NAFLD组中受过高等教育、代谢综合征和胰岛素抵抗患病比例均较非NAFLD组高;新发NAFLD组血清补体C3和C4中位数浓度(分别为1.18 g/L和0.34 g/L)均高于非NAFLD组(分别为1.06 g/L和0.32 g/L),两组间的分布均有统计学差异(PC3<0.001,PC4=0.010)。(2)在横断面研究和纵向研究中,每增加1个标准差补体C3水平均与高NAFLD风险显著相关(校正OR=1.65,95%CI:1.40,1.94;校正HR=1.20,95%CI:1.02,1.42;全部Ptrend<0.05),但补体C4水平与NAFLD无统计学关联(校正OR=1.04,95%CI:0.89,1.21;校正HR=1.10,95%CI:0.94,1.28;全部Ptrend>0.05)。(3)双向MR分析结果显示,分别采用原始和加权GRS作为工具变量,正向分析补体C3和C4均与NAFLD患病风险无统计学关联(补体C3:原始和加权结果均为校正OR=1.07,95%CI:0.98,1.18;补体C4:校正OR原始=0.98,95%CI:0.95,1.02;校正OR加权=0.99,95%CI:0.96,1.02;全部P>0.05);反向分析NAFLD与补体C3和C4关系亦无统计学关联(补体C3:校正β原始=0.15,95%CI:-0.31,0.60;校正β加权=0.15,95%CI:-0.36,0.66;补体C4:校正β原始=0.08,95%CI:-0.13,0.30;校正β加权=0.12,95%CI:-0.13,0.37;全部P>0.05)。结论:本研究发现(1)血清21种金属中,血清钼浓度与NAFLD风险呈负向的U型关系,而血清锌浓度与NAFLD风险呈正向线性关系,两者的联合作用亦增加NAFLD患病风险,提示血清低钼和高锌浓度可能是NAFLD风险的独立危险因素;(2)双向MR分析显示血清补体C3和C4水平改变与NAFLD患病风险无因果关系,提示补体系统可能在NAFLD发生发展中未发挥作用,结果需在较大队列人群和其他种族进行验证。