烟草是重要的科研模式生物和经济作物。对烟草抗病相关基因的研究不仅可以帮助我们认识到植物对病虫害侵染的防御机制,还有助于减少病虫害对农业生产的损失。植物丝裂源活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应是植物细胞内多条应答外源刺激信号通路的节点,其在植物的抗病抗逆和生长发育中扮演着重要的角色。然而对该基因家族在烟草中的研究并不完善。本论文以烟草MAPK基因为研究对象,重点阐述其在分类、进化、抗病功能及分子机制方面的研究内容。本研究的主要结果如下:①利用已经公布的烟草数据,如烟草甲基化基因组测序数据和EST数据等,设计引物从烟草c DNA文库中克隆和鉴定得到17个MAPK基因家族成员,其中11个基因是首次鉴定。系统发生分析显示,烟草中的MAPK成员与其他物种的MAPK基因,如拟南芥、水稻、杨树和葡萄,可以一同聚为6类,且物种间存在潜在的直系同源关系。氨基酸多序列比对显示,这17个基因具有MAPK家族成员特有的11个保守结构域和TXY/MEY基序,且序列间十分保守。②由于MAPK基因在植物的抗逆和抗病反应中具有重要作用,我们调查了烟草MAPK基因在外源刺激如水杨酸、茉莉酸和干旱处理下的转录水平表达情况。q RT-PCR分析表明,共有9个烟草MAPK基因的表达受到水杨酸的调控,11个基因的表达受到茉莉酸的调控,以及6个MAPK基因受到干旱胁迫的调控。这些结果说明烟草的MAPK基因在植物的抗逆抗病方面可能具有重要作用。③利用已经公布的茄科植物基因组数据,鉴定番茄、土豆、茄子和辣椒的MAPK基因家族成员。连同烟草和外群拟南芥的MAPK基因,共同研究该基因家族在茄科植物中的进化历史。基因数目分析表明,植物中的MAPK基因在数目上比较保守,大约都在20个左右。系统发生分析显示,该基因家族存在基因的扩增和缺失现象。此外,通过对基因结构的调查发现,尽管编码区结构保守,但该家族基因的内含子数目和长度却存在差异。分子进化分析显示,绝大多数MAPK基因Ka/Ks<1,然而仍然有一些MAPK(如MKA1、MKA8和MKB1)基因间的Ka和Ks比值大于1,暗示着这些基因可能存在正向选择的迹象。④选取烟草Nt MPK2基因作为研究对象。首先调查了Nt MPK2的基因结构和启动子结构,发现该基因的启动子具有多个抗逆抗病相关转录因子的结合位点,暗示该基因可能参与植物抗病抗逆相关功能。对该基因不同的组织时期表达情况进行q RT-PCR分析显示,该基因主要在植物的叶片和花中表达,暗示其在这两个组织中行使功能。然后构建了35S:Nt MPK2超表达载体,并将该基因利用农杆菌介导法转入烟草基因组中。得到烟草转基因株系后,从基因组水平、RNA水平以及抗生素筛选的方法鉴定得到多株转基因阳性植株。⑤对野生型烟草和Nt MPK2转基因阳性植株施以有毒病原菌Pst DC3000的侵染。病理分析结果显示,野生型烟草在受到病原菌侵染后表现为叶片发黄等明显的染病症状,然而三株烟草Nt MPK2转基因株系则表现出了轻微染病或不染病的症状。对接种后野生型和转基因烟草叶片病原菌的菌落数目进行了统计。结果显示,在接种24小时后,野生型烟草叶片菌落的数目明显高于三个转基因株系。上述结果表明Nt MPK2转基因赋予了烟草对有毒菌株Pst DC3000的抗病能力。为了进一步了解Nt MPK2的抗病能力,选取了可以引起植物超敏反应的Pst DC3000无毒菌株,对野生型和Nt MPK2转基因烟草施以接种,并统计侵染该病原菌0、12、24、36和48小时后叶片中含有的菌落数目。结果显示接种24小时后,野生型烟草含有的菌落数目明显高于转基因烟草。然而接种36小时后,两者的菌落数目都出现了居高不下的现象。直到接种48小时后,转基因型烟草菌落数目明显高于野生型。这一结果暗示着烟草可能具有多种途径用于防御Pst DC3000无毒病原菌的侵染。⑥为了探索烟草对Pst DC3000无毒病原菌的应答机制和Nt MPK2介导的抗病反应,我们选取四个样本(野生型烟草和转基因烟草、侵染Pst DC3000无毒菌株后的野生烟草和转基因烟草)提取RNA,并用RNA-seq的方法获得其转录组数据并对其进行de novo组装。组装分析共得到215,050条Contigs和152,824个Unigenes。我们又利用测序的reads计算每个样本基因的表达量,并比较样品间基因的差异表达,从而鉴定出1,325个受到病原Pst DC300调控的基因和32个受到Nt MPK2影响的基因。对1,325个受到病原Pst DC300调控的基因进行功能注释,GO分类结果显示这些差异表达的基因功能分布十分广泛,主要集中在结合、催化、转录调节子、酶调节子、代谢过程、细胞过程、生物调节过程、转运蛋白和应答刺激反应等多种功能。进一步探索这些差异表达基因的功能显示,多条信号通路参与到了烟草对Pst DC3000的防御反应。这些通路包括水杨酸通路、茉莉酸通路、乙烯通路以及次级代谢产物的生物合成等。对受Nt MPK2影响的差异表达基因进行功能分析显示,这些基因包括富含甘氨酸的细胞壁结构蛋白、脱落酸与环境压力诱导蛋白TAS14、天冬酰胺合成酶、GDSL丝氨酸脂酶/脂肪酶等。此外,许多非编码RNA也可能受到Nt MPK2的调控,从而参与到了烟草对病原的防御作用。通过开展本课题,我们从基因组水平、进化水平、功能实验验证以及转录组水平系统地探索了烟草MAPK基因的各方面信息。为今后了解烟草抗病抗逆反应机制提供重要线索,同时也为新的抗病相关基因和非编码RNA的鉴定提供了参考依据。