研究背景慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种常见病和多发病。在世界范围内患病率和死亡率都很高,经济社会负担重,已成为一个重要的公共卫生问题。据世界银行／世界卫生组织公布,至2020年COPD将位居世界疾病经济负担排名的第5位。COPD严峻的发病形势及其对人类健康所造成的重大威胁缘于人们对COPD的认识不足。加强并深入COPD的研究,特别是对其病理改变相关机制进行探讨,将有助于寻找COPD防治的新靶点,制定更切实有效的防治策略。早在半个多世纪以前,Spain DM[1]等就提出：COPD气流受限和气道狭窄的部位起始于小气道,其本质是小气道壁炎症和纤维化。但由于小气道(内径<2mm)特殊的病理解剖和病理生理的特点,以及研究方法和技术的受限,在此后的几十年里,对于COPD小气道发病机理的研究进展缓慢。近年来,随着细胞和分子生物学、分子病理技术、实验动物学的发展以及新的技术和实验方法的出现,COPD小气道的研究进入了一个新阶段。小气道壁增厚是COPD的重要病理改变,并且与COPD呼气气流受限密切相关[2]。小气道周围肌成纤维细胞聚集是导致小气道壁增厚的原因之一。小气道周围肌成纤维细胞主要来源于：①小气道周围成纤维细胞；②小气道平滑肌细胞；③循环中的成纤维干细胞；④上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。EMT是指极化的上皮细胞经历多种生物化学的改变最终表现出间质细胞特性的过程。多项研究证实,EMT与多种器官纤维化的发生、发展有着密切的关系。近年来,EMT在COPD疾病发生发展中的作用日益为研究者所重视[3]。新近研究表明,EMT在COPD患者小气道上皮明显存在,且与COPD的主要危险因素吸烟密切相关,经历了EMT的小气道上皮细胞能穿透基底膜迁移到黏膜下层转化成成纤维细胞/肌成纤维细胞。这些结果显示小气道上皮细胞EMT的发生是COPD小气道壁增厚和纤维化的重要因素。然而迄今为止,COPD小气道上皮细胞EMT的研究仅限于现象的描述,其发生机制鲜有研究报道。我们前期研究证实了尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)及其受体(uPA receptor, uPAR)在COPD的组织重塑中有重要作用。那么,uPA及uPAR对于COPD小气道上皮细胞EMT的发生是否具有作用?如有作用,其机制是什么?本研究试图从人肺组织标本和体外细胞实验两个层面来探讨uPA及uPAR在COPD小气道上皮EMT发生中的作用,从一个新的角度阐述COPD小气道重塑的病理机制,为COPD的有效防治提供新的靶点。研究目的探讨uPA和uPAR在COPD小气道上皮EMT中的作用及其相关分子机制方法1.通过COPD患者肺组织标本观察小气道上皮EMT状况及其与uPA/uPAR之间的关系(1)病例选择：选择因肺部病变行肺叶切除术的患者78例,术前行肺功能检查,按照慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)2011修订版的诊断标准及吸烟史,将患者分为COPD组,肺功能正常对照组(其中分为对照吸烟组和对照不吸烟组)。(2)通过免疫组织化学方法检测肺组织标本小气道上皮EMT上皮细胞分子标志物E-cadherin和间质细胞分子标志物vimentin, uPA和uPAR的表达。(3)结合患者肺功能资料,分析肺组织小气道上皮间质细胞标志物vimentin, uPA和uPAR的表达与FEV1%的相关性；分析肺组织小气道上皮uPA和uPAR的表达与间质细胞标志物vimentin表达的相关性。2.体外培养人小气道上皮细胞HSAEpiCs研究香烟提取物(cigarette smoke extract, CSE)对小气道上皮EMT的影响,阐明uPA及uPAR在小气道上皮细胞EMT中的作用,探讨其分子机制。(1)CSE对HSAEpiCs细胞EMT的影响：①通过倒置相差显微镜观察细胞形态变化；②通过qRT-PCR、Western Blot方法检测上皮细胞标志物E-cadherin和a-catenin,间质细胞标志物N-cadherin和a-SMA的表达；③通过Transwell方法检测CSE对HSAEpiCs细胞迁移的影响。(2)uPAR在CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT中的作用及分子机制研究：①CSE对HSAEpiCs细胞uPAR表达的影响：通过qRT-PCR. Western Blot方法检测uPAR的表达变化。②沉默uPAR基因表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：通过RNA干扰技术沉默uPAR表达,采用qRT-PCR和Western Blot方法分别验证uPAR的表达；通过倒置相差显微镜观察沉默uPAR基因表达后对细胞形态的影响；通过Western blot方法检测干扰uPAR基因表达后EMT相关标志物的变化。(3) PI3K/Akt信号通路对uPAR诱导的HSAEpiCs细胞EMT的影响：通过Western Blot方法检测CSE对p-Akt表达的影响；通过Western Blot方法检测沉默uPAR表达对PI3K/Akt信号通路的影响；通过Western Blot方法检测LY294002(PI3K抑制剂)对EMT相关标志物表达的影响。(3)uPA在CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT中的作用及分子机制研究：①CSE对HSAEpiCs细胞uPA表达的影响：通过qRT-PCR、Western Blot方法检测uPA的表达变化。②抑制uPA表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：氨氯吡咪(uPA抑制剂)抑制uPA表达,通过倒置相差显微镜观察抑制uPA表达对细胞形态的影响；通过Transwell方法检测抑制uPA表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞迁移能力的影响；通过Western Blot方法检测抑制uPA表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT相关标志物的变化。③uPA过表达对HSAEpiCs细胞EMT的影响：转染高表达uPA质粒,通过Western Blot方法验证uPA表达；通过倒置相差显微镜观察uPA过表达对细胞形态的影响；通过Transwell方法检测uPA过表达对HSAEpiCs细胞迁移能力的影响；通过Western Blot方法检测uPA过表达对HSAEpiCs细胞EMT相关标志物的变化。④沉默uPAR基因表达对uPA过表达诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：通过Western Blot方法验证沉默uPAR基因表达对uPA过表达诱导HSAEpiCs细胞EMT相关标志物的变化。结果1. COPD患者小气道上皮EMT标记物、uPA. uPAR表达及其它们之间的相关性分析(1)小气道上皮EMT标记物的表达：COPD患者小气道上皮细胞E-cadherin表达降低,相应部位的间质细胞标志物vimentin表达增加；COPD组、对照吸烟组患者小气道上皮vimentin阳性染色细胞数较对照不吸烟组明显增多；COPD吸烟组、COPD不吸烟组患者小气道上皮vimentin阳性染色细胞数较对照吸烟组比较表达增多；COPD吸烟组小气道上皮vimentin阳性染色细胞数同COPD不吸烟组比较无显著差异。(2)小气道上皮uPA和uPAR的表达：uPAR蛋白在COPD组、对照吸烟组患者小气道上皮细胞表达显著高于对照不吸烟组；COPD组小气道上皮细胞uPAR蛋白与对照吸烟组比较表达明显升高；uPAR在COPD吸烟组与COPD不吸烟组小气道上皮细胞表达无显著差异；uPA蛋白在COPD组、对照吸烟组患者小气道上皮细胞表达显著高于对照不吸烟组；COPD组小气道上皮细胞uPA蛋白显著高于对照吸烟组。(3)小气道上皮EMT标记物、uPA和uPAR的表达与肺功能之间的相关性分析：小气道上皮vimentin阳性染色细胞数、uPAR和uPA表达与FEV1/预计值%呈显著负相关；小气道上皮uPAR、uPA蛋白表达与间质细胞标志物vimentin阳性染色细胞数呈显著正相关。2.uPA及uPAR在CSE诱导小气道上皮细胞EMT中的作用及其分子机制(1)CSE对HSAEpiCs细胞EMT的作用：CSE干预后,HSAEpiCs细胞由鹅卵石状上皮形态变成梭形、纺锤形；上皮细胞标志物E-cadherin、α-catenin表达下调,而间质细胞标志物N-cadherin和a-SMA表达上调；HSAEpiCs细胞迁移能力明显增强。(2) uPAR在CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT中的作用及分子机制研究：①CSE对HSAEpiCs细胞uPAR表达的影响：CSE干预后显著增加uPAR的表达；②沉默uPAR基因表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：沉默uPAR基因表达的HSAEpiCs细胞在CSE干预后细胞呈鹅卵石状的上皮形态；沉默uPAR基因表达能抑制CSE诱导的上皮细胞标志物E-cadherin、α-catenin蛋白表达下调和间质细胞标志物N-cadherin和a-SMA蛋白表达上调。③PI3K/Akt信号通路对uPAR诱导的HSAEpiCs细胞EMT的影响：CSE干预后,p-Akt表达升高；uPAR基因沉默后,p-Akt及下游信号分子表达显著降低,尤其在CSE干预组,给予PI3K抑制剂LY294002后,能降低CSE诱导的PI3K/Akt信号通路活化,并抑制EMT的发生。(3)uPA在CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT中的作用及分子机制研究：①CSE对HSAEpiCs细胞uPA表达的影响：CSE干预后显著增加uPA的表达。②抑制uPA表达对CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：氨氯吡咪抑制uPA表达后,在CSE干预后细胞保持鹅卵石状的上皮形态；氨氯吡咪抑制CSE诱导HSAEpiCs细胞迁移能力增强；氨氯吡咪抑制CSE诱导HSAEpiCs细胞EMT。③uPA过表达对HSAEpiCs细胞EMT的影响：uPA过表达促进细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转变；uPA过表达促进HSAEpiCs细胞迁移能力增强；uPA过表达促进HSAEpiCs细胞EMT。④沉默uPAR基因表达对uPA过表达诱导HSAEpiCs细胞EMT的影响：沉默uPAR基因表达能部分逆转uPA过表达诱导的HSAEpiCs细胞EMT。结论1.COPD患者小气道上皮存在明显EMT现象,并且分别与高表达的uPA和uPAR密切相关。2. uPAR对小气道上皮细胞EMT具有调控作用,其可通过PI3K/Akt信号通路调控EMT发生。3.uPA对小气道上皮细胞EMT同样具有调控作用,部分依赖于uPAR的表达。