第一部分:IPF中医证型分布频率以及益气活血法治疗IPF的meta分析目的:特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种进展性的纤维增殖性呼吸系统疾病,由于IPF中纤维化发生的潜在机制以及纤维化进展的详细过程仍不为人所知,传统的抗炎、抗氧化以及抗纤维化药物均无法带来实质性的临床疗效,到目前为止尚缺乏有效的西医治疗方法,这一治疗现状凸显出IPF机制研究的重要性。而中医药在IPF的防治中具有独特性,其辨证论治以及辨病论治相结合的防治思路,能在IPF疾病发展的不同阶段发挥着独特的临床疗效,但是每位医家对本病的认识理解不同,辨证思路也繁杂多样,致使本病的辩证分型以及相应的治法方药各不相同,虽然均能发挥良好的临床疗效,但难以形成IPF的中医诊治共识和规范。由于辨别“证候”的过程是中医“辨证论治”的前提条件,因此本研究将针对IPF中医辨证分型的“百家争鸣”现状,对IPF的中医证候分布频率进行单组率meta分析并探讨我国IPF中医证型的分布特点。由于中医药在本病的“论治”过程中,能够发挥出独特的临床疗效,但是目前已有的中医药治疗IPF的随机对照临床研究(RCT)存在着样本量不足等弊端,一直限制此类研究结果的可靠性,而meta分析能将多个同质的研究资料进行分析和概括,通过增加样本量来增加结论的可信度以及解决研究结果的不一致性的优势,因此本研究将针对我国最常见中医证型的治疗方法的RCT研究进行系统分析,以期望从循证医学角度去探讨临床治疗效果方法:(1)单组率的meta分析可用于各种率或比的综合分析,除此之外,还可对疾病不同临床亚型、病理分型等方面进行综合分析。因此本研究通过对IPF中医证候分布规律的文献进行筛选及数据提取,采用R软件(3.6.0版本)进行单组率的meta分析,并采用亚组分析以及回归分析去寻找异质性来源。(2)本研究通过检索益气活血类中药治疗IPF的RCT研究,根据不同研究结果中结局变量的分类,采用R软件(3.6.0版本)分别进行二分类变量以及连续型变量的meta分析。结果:(1)最终纳入18篇文献共计1949例患者的单组率meta分析结果显示,我国肺间质纤维化的主要中医证候分布特征为气虚血瘀证、肺脾肾气虚证以及痰浊壅肺证。按照中国地区所处地理纬度分布将纳入文献分为高纬度地区、中纬度地区以及低纬度地区,亚组分析以及回归分析结果显示中纬度地区气虚血瘀证发生率较高,差异具有统计学意义,中纬度地区肺脾肾气虚以及痰浊壅肺证发生率均较高,但差异不具有统计学意义,低纬度地区气阴两虚证以及外感犯肺证发生率较高,但差异不具有统计学意义,以上说明气虚血瘀证型是我国最常见的中医证型,与文献研读所述之“气虚血瘀证是IPF发生发展的主要病机”相符合。(2)最终纳入33篇RCT研究,结果显示益气活血类中医药能有效地改善IPF患者的症状,提高其运动耐受力以及T细胞免疫能力,延缓肺功能的降低,还能起到抗炎及抗凝的作用。进一步整理所纳入研究中所采用的中医药,尽管益气活血类中医药的剂型方药差异显著,但不外“补”,“通”二法论治IPF,补益气虚的中药多采用黄芪、党参等,滋补肺肾类中药多采用金银花、石斛等,活血化瘀的中药多采用川芎、丹参等化痰理气类中药多采用川贝母、柴胡等。第二部分:IPF中长链非编码RNA表达谱分析及IPF(气虚血瘀证)的验证目的:人类基因组中约有98%为非编码RNA(Non-coding RNAs,nc RNA),不仅数量庞大而且能在表观遗传学、转录以及转录后等多层面调控基因的表达而成为目前的研究热点,除此之外,转录组还发挥着连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的纽带作用,因此本课题组将研究重点聚焦于IPF(气虚血瘀证)中非编码RNA的调控机制。(1)其中的lnc RNA是一种多功能的适配分子,能通过与蛋白质、DNA、其他RNA相结合而发挥多样的生物学功能,但是由于IPF疾病的特殊性,与之相关的转录组研究可能存在低丰度转录本的分析结果不准确以及假阳性、假阴性的结论,因此本研究将采用数据库挖掘的方式对不同阵列平台的转录本研究结果进行整合分析,去探索获得更可靠、更一致的与IPF发病机制及进展相关联的关键调控因子。(2)分别在IPF(气虚血瘀证)患者以及健康体检者中去验证数据库挖掘所获得关键调控因子的表达情况。方法:(1)整合分析GEO芯片数据库中与IPF相关的三个数据集GSE2052、GSE44723以及GSE24206。采用R软件(3.6.0版本)中的limma包进行差异基因分析,Cluster3.0对数据进行归一化处理以及log2转换处理。通过GO分析及KEGG分析对所筛选的差异表达基因进行注释。对差异表达的基因进行蛋白质-蛋白质互作网络分析并筛选出核心基因。采用Cytoscape中的不同插件对核心基因进行GO分析以及构建生物通路关系网络。分别采用RAID version 2.0数据库以及TRRUST version2.0数据库分析功能模块间的pivot节点并获得IPF中差异表达的lnc RNAs、mi RNAs以及转录因子(transcription factors,TFs)。(2)收集2018年1月至2019年6月符合气虚血瘀证型诊断标准的IPF患者,并收集相应的健康体检者,对上述受试者的外周血标本进行单核细胞分离,并采用RT-PCR方法进行差异基因的验证。结果:(1)采用生物信息分析的方法分析GEO芯片数据库中的数据集并最终获得与IPF发病机制相关的候选lnc RNAs、TFs以及min RNAs基因,如MALAT1,FENDRR,RNU1-1,TUG1,E2F1,TP53,SP1,YBX1,BRCA1,E2F4,CREB1,CIITA、has-mi R-663a、has-mi R-205-5p、has-mi R-129-5p、has-mi R-495-3p、has-mi R-193b-3p、has-mi R-186-5p等。(2)与健康对照组相比,IPF(气虚血瘀证)的lnc RNA MALAT1、E2F1高表达,而YBX1低表达,差异具有统计学意义,而lnc RNA FENDRR在两组中表达差异不显著。第三部分:MALAT1及E2F1在成纤维细胞表型转化中的调控作用目的:探讨MALAT1以及E2F1是如何在肺纤维过程中发挥调控作用的。方法:(1)采用TGF-β1诱导体外肺纤维化模型并分别在形态学、m RNA水平及蛋白水平验证体外肺纤维化模型的构建效率。(2)检测TGF-β1诱导细胞模型的不同时间以及不同细胞系中MALAT1的表达变化情况。(3)采用瞬时转染方法敲低MALAT1或过表达MALAT1,并分别采用划痕实验、细胞凋亡、细胞周期、免疫荧光等试验方法评估MALAT1对成纤维细胞迁徙、增殖等方面的影响,再采用Western Blot方法验证敲低MALAT1或过表达MALAT1时体外肺纤维化模型中上皮向间质转化(EMT)的变化情况。(4)在敲低MALAT1或过表达MALAT1时,分别从m RNA水平以及蛋白水平检测转录因子E2F1的表达情况。(5)敲低MALAT1或过表达MALAT1的同时共转染过表达E2F1或敲低E2F1,分别观察细胞凋亡、细胞周期以及羟脯氨酸含量变化。(6)敲低MALAT1或过表达MALAT1的同时共转染过表达E2F1或敲低E2F1时,在蛋白水平观察相应指标的变化。结果:(1)采用10ng/ml的TGF-β1诱导肺泡II型上皮细胞处理72小时,可诱导体外肺纤维化细胞模型。(2)随着体外细胞模型诱导时间的延长,MALAT1的表达水平逐渐增高。(3)免疫荧光试验发现随着MALAT1的敲低α-SMA的荧光表达下降,而当MALAT1的过表达时α-SMA的荧光表达增强。划痕细胞试验发现过表达MALAT1时成纤维细胞的迁徙能力增强,而敲低MALAT1时成纤维细胞的迁徙能力下降。进一步Western Blot试验发现过表达MALAT1时出现EMT,而当敲低MALAT1时出现MET。(4)在m RNA水平和蛋白水平验证发现,过表达MALAT1时E2F1表达升高,敲低MALAT1时E2F1表达下降。(5)在细胞凋亡方面:当过表达MALAT1时细胞凋亡下降,而共转染敲低的E2F1时能逆转并出现细胞凋亡增强;当敲低MALAT1时细胞凋亡增强,而共转染过表达的E2F1时能逆转并出现细胞凋亡下降。在细胞周期方面:当过表达MALAT1时细胞S期比例增高,而共转染敲低的E2F1时能逆转并出现细胞S期比例下降;当敲低MALAT1时细胞S期比例下降,而共转染过表达的E2F1时能逆转并出现细胞S期比例增高。在HYP表达方面:当过表达MALAT1时HYP表达升高,而共转染敲低的E2F1时能逆转并出现HYP表达下降;当敲低MALAT1时HYP表达下降,而共转染过表达的E2F1时能逆转并出现HYP表达升高。(6)当过表达MALAT1时出现EMT且出现p-Rb表达增高,HDAC1表达下降,而共转染敲低的E2F1时能逆转并出现MET以及p-Rb表达下降,HDAC1表达增高;当敲低MALAT1时出现MET且出现p-Rb表达下降,HDAC1表达增高,而共转染过表达的E2F1时能逆转并出现EMT以及p-Rb表达升高,HDAC1表达下降。结论:(1)本研究基于文献整理并分析IPF中医证候分布特征,进一步明确了“气虚血瘀证”为辨治核心的IPF中医病机理论,并发现益气活血类中药可能是临床上有效治疗IPF的方法。(2)在IPF中采用大数据生物信息分析法筛选出具有表达差异的长链非编码RNA MALAT1以及转录因子E2F1,并在IPF(气虚血瘀证)的临床样本中确认了候选基因的表达异常。(3)本研究发现MALAT1与E2F1是参与调控肺纤维化的关键基因。(4)MALAT1可能是经由Rb-HDAC1-E2F1信号轴参与促进肺纤维化的形成。(5)MALAT1与E2F1可以作为潜在的IPF(气虚血瘀证)诊断候选标志物,为中医药(益气活血法)防治IPF研究提供新的思路以及治疗靶点。