背景:银屑病作为一种慢性免疫相关的炎症性疾病,其病因病机不清,迄今尚无满意疗法。近年发现,干细胞具有免疫调剂作用,有望治愈银屑病。源于真皮的干细胞即皮肤前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)易于取材、来源丰富、无异源性干扰,可成为银屑病干细胞移植的重要来源。而目前关于SKPs对银屑病的治疗尚未见报道。目的:通过构建体外银屑病三维皮肤模型,移植SKPs至银屑病模型,应用组织学、分子生物学等方法观察银屑病模型移植前后皮肤组织细胞、炎症因子及基因表达的变化,以探讨SKPs对银屑病的治疗作用及机制,为进一步体内研究SKPs治疗银屑病提供实验依据。方法:1.构建体外银屑病三维皮肤模型:(1)SKPs、角质形成细胞(keratinocytes,KC)、成纤维细胞(fibroblasts,FBs)的分离和培养:取新生BALB/c小鼠,分离表皮和真皮,真皮分离的细胞培养SKPs、FBs;儿童包皮的表皮分离的细胞悬液培养KC。(2)正常三维皮肤模型的构建及鉴定:将获取的FBs与Ⅰ型鼠尾胶原混合建立三维皮肤真皮结构,然后在其表面接种KC,行气-液界面培养以构建正常三维皮肤模型。采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察皮肤结构和免疫组化染色显示表皮KC特异性抗体CK10及真皮FBs特异性抗体VIM表达情况。(3)银屑病三维皮肤模型的构建:在构建正常三维皮肤模型的KC培养基中加入肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)构建银屑病三维皮肤模型,HE染色观察银屑病三维皮肤组织病理学变化。2.SKPs治疗银屑病三维皮肤:(1)实验分组:将成功构建的三维皮肤随机分为4组:正常组、模型组、治疗组和对照组。(2)SKPs移植到银屑病三维皮肤:将红色荧光PKH26标记的SKPs移植到治疗组,对照组注射Hanks液。(3)标本收集:分别收集正常组、模型组造模第3、6、9、12天以及治疗组和对照组治疗后第3、6天的上清液。同时收集上述4组造模或治疗后6天的皮肤组织。HE染色观察皮肤组织病理学变化。(4)指标检测:采用ELISA法检测各组上清液中的IL-1、IL-12、IL-17浓度以及qPCR检测各组组织IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表达水平。3.采用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示,采用t检验。P<0.05差异有统计学意义。采用Graphpad Prism 6软件分析数据绘图。结果:1.原代分离培养的KC和FBs在镜下为贴壁生长,KC呈铺路石样或卵石样形态,FBs呈多角形或菱形外观;SKPs为悬浮生长,呈圆形或球形克隆样细胞团,细胞球中央颜色较深,周围明亮。2.三维皮肤模型外观表现:(1)正常三维皮肤表现为白色半透明状,边缘整齐无卷曲;(2)银屑病三维皮肤呈乳白色不透明,边缘卷曲,较正常三维皮肤缩小变厚。3.三维皮肤模型病理组织学改变及鉴定:(1)HE染色下,正常三维皮肤由表皮层和真皮层组成,分界清楚;表皮层细胞排列较整齐、形态一致;真皮层由少量细胞和胶原构成,结构紧密。(2)银屑病三维皮肤表皮明显增厚。(3)免疫组化染色显示正常三维皮肤表皮细胞着棕黄色、表达CK10阳性即为KC;真皮层着深棕黄色、表达VIM阳性即为FBs,正常三维皮肤模型成功构建。4.SKPs移植到银屑病三维皮肤后其冰冻切片显示携带红色荧光的SKPs弥散分布于皮肤组织中,并在组织中存活良好。5.SKPs对银屑病三维皮肤的作用:(1)经SKPs移植治疗后治疗组三维皮肤表皮及棘层明显变薄;而对照组则改善不明显。(2)各组上清经ELISA检测后,模型组IL-1、IL-12、IL-17表达水平较正常组明显升高(P﹤0.05);但经SKPs移植后,IL-1、IL-12和IL-17表达水平较模型组及对照组均明显降低(P﹤0.05);对照组与模型组比较,IL-1、IL-12和IL-17水平降低不明显(P>0.05)。(3)各组皮肤组织经基因检测后,模型组表达IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平较正常组显著升高(P﹤0.05);然而经SKPs移植后,治疗组IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA表达均较模型组和对照组明显降低(P﹤0.05);对照组与模型组比较,IL-1a、IL-12a、IL-17a mRNA水平无显著降低(P>0.05)。结论:1.体外培养的KC、FBs可与Ⅰ型鼠尾胶原成功构建正常三维皮肤模型。2.在正常三维皮肤基础上,持续加入TNF-α和IFN-γ,可成功建立银屑病三维皮肤模型,为银屑病发病机制及治疗研究提供良好实验载体。3.将SKPs移植到银屑病三维皮肤,可减轻表皮厚度,降低炎症因子IL-1、IL-12、IL-17表达,从而起到缓解银屑病的作用。