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细胞自噬（简称自噬）是真核细胞内重要的降解与回收途径,在维持细胞在逆境下生存、清除细胞内有害物质、维持胞内物质平衡等方面发挥着重要作用。自噬过程包括自噬的诱导,自噬前体的成核,自噬前体膜延伸及封口,自噬体成熟,成熟自噬体与液泡的融合,及液泡内自噬体的降解与释放到胞质等环节,受到许多自噬相关蛋白（autophagy-related proteins,Atg）的调控。除Atg外,部分参与囊泡运输的蛋白也参与自噬过程。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中Rab（Ras genes from rat brain）小G蛋白Ypt（Yeast protein transport）作为分子开关调控细胞内囊泡的运输,部分Ypt蛋白也参与自噬。Rab蛋白常以模块蛋白,包括上游鸟嘌呤交换因子（guanine nucleotide exchange factor,GEF）、Rab蛋白本身、下游效应蛋白,的形式行使功能。本实验室前期在酵母中的研究发现Vps21（即Ypt51,酵母Rab5的同源蛋白）及其GEF和效应蛋白所构成的Vps21模块蛋白也参与自噬。这些蛋白的缺失会导致大量自噬体状膜结构堆积在液泡膜边缘。蛋白酶保护实验显示这些堆积的膜结构没有封口,定性为自噬前体。自噬前体的封口是自噬过程中一个非常重要的环节,但其调控因子和分子机制仍没有被完全了解。本论文在获知Vps21模块蛋白缺失后自噬前体不能封口的基础上,试图进一步解析自噬前体封口的分子机制。Vps21在细胞内吞途径中的下游蛋白,转运必需内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport,ESCRT）,是一个重要的膜剪切与封口分子机器,作用于多个生命活动过程中膜性细胞器的剪切与封口。有人推测ESCRT复合体在自噬过程中有可能参与对自噬前体封口,但至今没有实验证据。本研究将重点探讨ESCRT复合体亚基缺失对自噬的影响,尤其是对自噬前体封口的影响。在确认ESCRT复合体亚基缺失影响自噬前体封口的基础上,探讨Vps21模块蛋白通过ESCRT复合体共同参与自噬前体封口的分子机制,得到了以下几方面的主要结果:1.Vps21模块蛋白作用于Ypt1下游与Ypt7上游,参与自噬前体的封口及自噬体上Atg蛋白的脱离本文首先通过双突变体的上位性分析研究了 Vps21与Ypt1的上下游关系。Ypt1作用于自噬起始阶段,调控自噬体组装位点（phagophore assembly site,PAS）的形成与自噬前体膜的延伸。Ypt1突变（ypt1-1）造成Atg8在胞质内呈多点状分布,且不与Atg11共定位,说明PAS形成受阻。ypt1-1vps21Δ双突变体中自噬缺陷表型与ypt1-1类似而不同于vps21Δ菌株,说明自噬过程中Vps21作用于Ypt1的下游。其次,基于前期发现Vps21模块蛋白缺失菌株堆积自噬体状膜结构和蛋白酶保护实验初步判断这些膜结构未封口的情况下,本研究通过多次重复验证与统计分析肯定了这些膜结构未封口,为自噬前体。Vps21模块蛋白缺失还导致自噬前体上Atg蛋白不能脱离,支持这些突变体中自噬前体未封口的结论,说明Vps21模块蛋白参与自噬前体的封口。最后,同样通过双突变体上位性分析,发现自噬过程中Vps21作用于调控成熟自噬体与液泡融合的Ypt7的上游。2.Vps21作用于磷脂磷酸酶Ymr1上游,影响自噬体上PI3P的清除当自噬前体封口后,定位于自噬体上的磷脂磷酸酶Ymr1介导闭合自噬体上PI3P的清除,预期Vps21作用于Ymr1的上游,且Vps21缺失菌株中自噬前体上PI3P未被清除。通过上位性分析发现vps21Δ和vps21Δymr1Δ中自噬体均以新月状成簇堆积于液泡边缘,且两个突变体中自噬体均未封口,为自噬前体;而ymr1Δ中自噬体呈分散状,已封口,表明Vps21作用于Ymr1上游。通过使用PI3P的探针DsRed-FYVE,发现vps21Δ、vps21Δymr1Δ、ymr1Δ中自噬前体或自噬体上PI3P均没有被清除,说明Vps21缺失确实影响了 PI3P的清除。进一步研究发现vps21Δ中Ymr1不能正确定位到自噬前体,表明Vps21通过影响Ymr1的定位影响了自噬体上P13P的清除。3.ESCRT复合体亚基缺失影响自噬前体封口内吞途径中Vps21/Rab5模块蛋白作用于ESCRT复合体上游。基于Vps21模块蛋白在自噬前体封口中有作用和ESCRT复合体对膜性细胞器有封口能力,推测Vps21模块蛋白极有可能借助ESCRT复合体对自噬前体封口。为了探讨Vps21模块蛋白通过ESCRT复合体对自噬前体封口的可能性,本研究首先检测了 ESCRT复合体亚基缺失对细胞自噬的影响情况。通过对ESCRT复合体全部亚基单独缺失菌株中GFP-Atg8的定位和降解进行检测,发现绝大部分亚基缺失都会不同程度地影响自噬进行,说明ESCRT复合体在自噬过程中并不是只通过某一个亚基发挥作用。对ESCRT复合体关键亚基Snf7和Vps4缺失菌株的自噬缺陷表型进行重点研究,荧光和电子显微镜实验发现这些突变体中自噬体状膜结构成簇堆积于液泡边缘,蛋白酶保护实验发现这些膜结构为未封口的自噬前体,多种Atg蛋白（Atg2、Atg5、Atg11、Atg17等）仍定位于自噬前体上。说明Snf7和Vps4缺失菌株的自噬缺陷表型与Vps21模块蛋白缺失菌株的自噬缺陷表型非常相似,缺失后都影响自噬前体封口。4.ESCRT复合体亚基Snf7通过与Atg17互作被招募至自噬前体上前期实验结果显示,Vps21模块蛋白与Atg自噬蛋白之间没有直接的互作,但有文献报道ESCRT-Ⅲ亚复合体部分亚基可能与Atg1复合体存在互作。本研究首先通过BiFC实验进行互作筛查,对筛到的互作通过GST pulldown进行验证,发现ESCRT-Ⅲ关键亚基Snf7与Atg17存在互作,且互作发生在mCherry-Atg8标记的自噬前体上。然后通过荧光观察Snf7-mCherry与GFP-Atg8在自噬体形成过程中的共定位,发现Atg17缺失显著降低了 Snf7-mCherry与GFP-Atg8的共定位;而Atg17-GFP与mCherry-Atg8的共定位不受Snf7缺失影响;Snf7-mCherry与Atg17-GFP的共定位也不受Atg8缺失影响,说明Snf7通过与Atg17互作被招募到mCherry-Atg8标记的自噬前体上。5.Vps21介导Snf7与Atg17的互作及Snf7在自噬前体上的定位由于自噬途径中Vps21模块蛋白与ESCRT复合体缺失均导致自噬前体不能封口,且ESCRT复合体亚基Snf7确实可以通过与自噬蛋白Atg17互作被招募至自噬前体,因此推测Vps21可能通过ESCRT的膜剪切与封口功能对自噬前体进行封口。为了了解Vps21模块蛋白与ESCRT复合体在自噬过程中的相互关系,本研究检测了 Vps21缺失对Snf7-Atg17的互作及Snf7在自噬前体上的定位的影响情况,发现Vps21缺失后Snf7与Atg17的互作显著减弱,并且Snf7在自噬前体上的定位比例显著下降,动态观察显示vps21Δ细胞中Snf7极少与自噬前体发生接触。说明在自噬途径中Vps21作用于ESCRT的上游,介导Snf7-Atg17的互作,影响ESCRT在自噬前体上的定位,从而极有可能利用ESCRT对自噬前体封口。以上内容明确指出Vps21模块蛋白和ESCRT复合体在自噬前体封口中均发挥作用,清楚展示Vps21模块蛋白影响Snf7与Atg17的互作及Snf7在自噬前体上的定位,顺势提出Vps21模块蛋白通过介导ESCRT复合体与Atg蛋白的互作影响ESCRT复合体定位到自噬前体上对自噬前体进行封口的可能分子机制。本论文为深入了解自噬前体封口的调控因子和分子机制打下了基础,也为探讨囊泡运输与细胞自噬的相互关系提供了重要数据。