研究背景我们的前期研究证实,晶状体脱离缺氧的生理状态,在体外培养条件下出现从赤道部向中央部的混浊,在这种皮质性白内障模型中Src-家族酪氨酸激酶(SFK)被异常激活,而用特异性SFK抑制剂PP1可以有效阻止晶状体的混浊,保持晶状体透明。此结果提示SFK异常激活在皮质性白内障形成过程中起关键作用。SFK可在不同细胞被高浓度H2O2激活,参与氧化应激引起的一系列级联反应。Ca2+稳态对维持晶状体透明至关重要,皮质性白内障的晶状体内钙离子显著增加,有关氧化损伤白内障模型的研究表明钙离子激活了钙蛋白酶继而引起晶状体蛋白降解导致晶状体的混浊。钙离子作为细胞内的第二信使参与了许多信号转导途径的激活,钙离子激活的转导通路与氧化应激激活SFK引起的一系列信号转导通路之间存在一定交联。实验性皮质性白内障是否通过SFK的激活,导致晶状体内钙离子浓度的增加,从而参与白内障的形成是本研究关注的问题。目的本研究观察Src-家族酪氨酸激酶抑制剂PP1对氧化损伤下晶状体内钙离子浓度的影响,探讨PP1阻止晶状体混浊的机理。方法用钙离子荧光探针Fluo-3/AM负载人晶状体细胞HLE-B3,用激光扫描共聚焦显微镜观察在不同浓度H2O2刺激后细胞内钙离子的荧光强度变化;进一步用0.1nmol/L PP1、0.3u/L过氧化氢酶和DMSO分别预处理细胞,观察在常规钙、低钙和高钙离子培养基的培养条件下,H2O2刺激后细胞内钙离子荧光强度的变化。将胚胎10天(E10)的鸡全晶状体分离后培养在含10%FBS的M199培养基中,连续培养10天并以此为对照组;在培养液中分别加入0.1nmol/LPP1、0.2u/L过氧化氢酶和50μmol/LVitamin C作为实验组。每天换液,观察、拍照记录并测量晶状体的混浊面积,计算晶状体混浊面积的百分比;检测体外培养第1、5、10天晶状体培养液中的钙离子浓度;用免疫印迹法检测体外培养10天晶状体囊膜p-Src表达水平的变化。结果不同浓度H2O2刺激后细胞内游离钙离子浓度升高,有剂量依赖效应。用0.1 mM H2O2刺激细胞,在常规钙培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内钙离子荧光强度增长幅度与DMSO组比分别降低28.5%±4.2%,33.8%±3.7% (t=4.281, 5.740; P<0.01);在低钙培养基中,三组细胞内钙离子荧光强度增强均不明显;在高钙培养基中,PP1组、catalase组的荧光强度增加幅度较DMSO组分别降低13.5%±1.8%和21.3%±2.4% (t=2.901, 3.219; P<0.01)。常规和高钙培养基中,PP1组和过氧化氢酶组细胞内钙离子荧光强度增长幅度均无明显差异(t=0.803, 1.47; P>0.05)。体外培养10天后,对照组晶状体出现了明显的皮质部的混浊,混浊面积百分比在第10天为52%,维生素C、过氧化氢酶和PP1处理组分别为10%、19%和13%,四组间有统计学差异(P<0.01)。晶状体在体外培养10天,培养液中钙离子浓度均增加,维生素C组、过氧化氢酶组和PP1组的钙离子浓度与对照组比明显降低(P<0.01),PP1组更明显,晶状体囊膜的p-Src的表达维生素C、过氧化氢酶和PP1处理组也比对照组明显降低(P<0.01),维生素C和PP1处理组抑制p-Src的作用较过氧化氢酶强(P<0.01)。结论晶状体上皮细胞在H2O2刺激下,出现钙离子从细胞外向胞内的流动增加,使细胞内游离钙离子浓度升高,Src-家族酪氨酸激酶特异性抑制剂PP1能有效预防钙离子的内流,提示PP1通过抑制氧化应激引起的钙内流增加,阻断了依赖钙离子激活的信号转导途径,阻止皮质性白内障发生。维生素C、过氧化氢酶与PP1一样能抑制实验性皮质性白内障的发生,还可以抑制晶状体中钙离子弄的升高,可能是通过抑制p-Src的活性保持晶状体上皮层的完整性来实现的。