牛流行热 (bovine ephemeral fever,BEF) 是由牛流行热病毒 (bovine ephemeralfever virus,BEFv) 引起的一种急性传染病,首先发现于19世纪中期的东非,随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区.该病传播迅速,流行面广,有一定的周期性,曾在我国多个省份多次发生,导致奶牛产奶量降低,乳品质下降,役用牛跛行或瘫痪,部分怀孕母牛流产,给养牛业造成重大经济损失.BEFV有5种结构蛋白,其中G蛋白是主要的免疫原性蛋白,其表面存在5个抗原位点,G<,1>为BEFV所特有,只与牛流行热病毒阳性血清发生反应,而其它位点与同科的相关病毒则存在交叉反应,因此我们选取G<,1>抗原表位进行克隆表达利蛋白纯化.将得到的重组G<,1>蛋白作为包被抗原,建立检测BEF血清抗体的间接ELISA方法,开发相关的试剂盒,为该病的快速诊断和疫苗免疫后的抗体水平监测提供技术支持. 本文从BEF中国标准毒株JB76H株中提取总RNA,通过RT-PCR方法扩增G<,1>抗原表位目的基因.序列分析发现,克隆的G<,1>抗原表位基因与NCBI/GenBank上登载的台湾株的核苷酸同源性为96.4﹪,氨基酸同源性为96.5﹪;与澳大利亚株的核苷酸同源性为89.1﹪,氨基酸同源性为90.8﹪.目的基因在GS115中得到胞外分泌的可溶性目的蛋白,蛋白大小约为26.0kDa;在BL21(DE3)中得到主要以包涵体形式存在的重组蛋白,蛋白大小约为41.54kDa.经SDS-PAGE、Western blot、ELISA、兔体免疫实验和特异性分析,两种蛋白均具有良好的反应原性、免疫原性和特异性,可作为包被抗原,建立ELISA方法. 本文以BL21(DE3)表达的重组蛋白作为包被抗原,经过各种反应条件的优化,建立了检测BEFV血清抗体的间接 ELISA方法.本研究表明,抗原的最适包被浓度为0.574μg/孔;血清和酶标抗体的最佳稀释度分别为1∶20和 1∶200;抗原包被后以37℃1h转入4℃过夜包被效果较好;封闭后以37℃1h、血清加入后以37℃1h、酶标抗体加入后以37℃1h反应,为ELISA最适反应温度和间隔时间.判定标准为:标准阴性血清对照孔OD<,490>值的平均值×2.1作为阈值,所测样品的OD<,490>值大于或等于阈值判为阳性,小于阈值判为阴性.该法有良好的敏感性、特异性和重复性,有临床实用价值.在毕赤酵母GS115中表达的可溶性目的蛋白作为包被抗原,也建立了间接ELISA方法.该方法敏感性和重复性较好,但特异性和符合性较差,其根本原因是目的蛋白纯度较低,必须有行之有效的纯化方法。该蛋白才有应用价值. 本文试验对ELISA试剂盒的开发作了初步研究，确定了试剂盒的组成成分,其保存条件、保存期、特异性、敏感性和符合性，以及批内和批间的稳定性都有了可靠的检验数据,有望开发成可上市的试剂盒.