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第一部分1,25(OH)2D3对高糖诱导大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞肥大的干预作用及机制研究目的:明确高糖诱导大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞肥大的作用;探讨1,25(OH)2D3改善高糖诱导大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞肥大的最适浓度;明确高糖所致心肌细胞肥大的作用是否通过多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]1。方法:体外培养大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞系,将细胞随机分为5个组,分别用不同浓度葡萄糖(LG:5.5、HG:25mmol/L)、不同浓度1,25(OH)2D3(VD3:10-9、10-8、10-7 mol/L)单独或联合干预心肌细胞,Image Pro Plus计算心肌细胞表面积,RT-PCR检测心肌肥大标志物及PARP1m RNA的表达,Western blot检测PARP1蛋白表达情况。随后,将细胞随机分为4个组:LG、LG+INO1001(PARP1抑制剂)、HG、HG+INO1001,计算各组心肌细胞表面积,检测心肌肥大标志物及m RNA表达及PARP1表达。结果:葡萄糖浓度为25mmol/L可诱导大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞表面积增大,心肌肥大标志物(β-MHC、ANF、BNP)m RNA表达升高;1,25(OH)2D3能以剂量依耐性的方式分别抑制高糖诱导的大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞肥大;高糖可诱导PARP1表达升高且高糖所致心肌细胞肥大与PARP1激活有关,1,25(OH)2D3能以剂量依耐性的方式抑制高糖引起的PARP1表达升高。结论:HG可诱导大鼠原代心肌细胞及H9C2细胞肥大,而1,25(OH)2D3呈剂量依赖性的发挥抗HG致心肌细胞肥大的作用并能抑制PARP1表达。第二部分慢病毒转染沉默VDR对H9C2心肌细胞肥大的影响及作用机制目的:构建慢病毒转染稳定沉默VDR的心肌细胞;探究高糖时VDR沉默对H9C2肥大的影响;明确1,25(OH)2D3的抗H9C2肥大作用是否通过经典的VD/VDR途径,是否与PARP1活性有关。方法:用Lenti-sh VDR感染H9C2,确定最佳感染复数(MOI)并用嘌呤霉素筛选细胞,建立稳定转染的心肌细胞。RT-PCR法检测慢病毒干预后细胞VDR m RNA的表达,Western blot法检测VDR蛋白表达。分别用LG、HG、INO-1001单独或联合干预稳转后的H9C2,检测心肌细胞表面积,心肌肥大标志物m RNA表达,以及VDR、PARP1的m RNA及蛋白表达。结果:Lenti-sh VDR对H9C2细胞无明显毒性;MOI为50的lenti-sh VDR能够有效的感染心肌细胞并可沉默VDR表达达70%以上。VDR沉默的H9C2无论是否用HG干预,较之正常对照组均可发现心肌细表面积增大、心肌肥大指标m RNA表达增高,PARP1蛋白表达增多,而INO-1001干预感染Lenti-sh VDR的H9C2细胞后,心肌细胞表面积无明显增大、心肌肥大指标m RNA表达无明显增高,PARP1蛋白表达降低(均P<0.05)。结论:Lenti-sh VDR可安全有效的感染H9C2并使VDR稳定沉默达70%以上。无论是否有HG环境,沉默VDR均可引起H9C2细胞肥大,且其机制与PARP1活化密切相关。第三部分1,25(OH)2D3对大鼠糖尿病心肌病的干预作用及其机制研究目的:研究VDR沉默对糖尿病大鼠心脏功能的影响;探讨1,25(OH)2D3干预大鼠糖尿病心肌病的作用及其机制。方法:60只SD大鼠,随机分为对照组(C组),糖尿病组(DM组),糖尿病+1,25(OH)2D3干预组(DM+VD3组),糖尿病+Lenti-sh VDR组(DM+Lenti-sh VDR组),糖尿病+Lenti-sh VDR+1,25(OH)2D3干预组(DM+Lenti-sh VDR+VD3组),每组12只。采用单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立糖尿病大鼠模型,心脏彩超评估心功能,无创鼠尾血压仪测量血压,全自动生化仪及ELISA法检测一般生化指标及炎症因子,HE及天狼星红染色检测心肌厚度及间质纤维化程度,PCR及(或)Western blot检测β-MHC、ANF、BNP、VDR、PARP1、SIRT1、TSC2、m TOR、p70s6k的m RNA及(或)蛋白表达情况。结果:成功构建大鼠糖尿病心肌病模型及VDR沉默模型。与C组相比,DM组大鼠左室室间隔(LVIVS)、左室后壁(LVPW)厚度和左室舒张/收缩末期内径(LVEDd/s)增大(P<0.05),DM+VD3组上述指标显著改善(P<0.05),而Lenti-sh VDR组无论是否用VD3干预上述指标较之对照组均显著增大(P<0.05),同时心肌肥大指标β-MHC、ANF、BNP的m RNA表达与上述趋势相同(P<0.05)。此外,胶原容积分数(CVF)和管周胶原面积/官腔面积(PCA/LA)在DM组及Lenti-sh VDR组显著增高(P<0.01),VD3干预组可显著降低DM组上述纤维化指标,但对VDR沉默组无影响。DM组、DM+Lenti-sh VDR组、DM+Lenti-sh VDR+VD3组较之DM+VD3组,PARP1蛋白表达升高,m TOR和p70S6K磷酸化水平升高,而SIRT1蛋白表达下降,TSC2磷酸化水平以及循环血CTRP3水平显著降低。结论:STZ单次腹腔注射可成功构建糖尿病心肌病大鼠模型;重组慢病毒能安全有效的转染糖尿病大鼠并使之稳定沉默VDR。1,25(OH)2D3可通过PARP1/SIRT1/m TOR通路抑制糖尿病心肌肥大和心肌间质纤维化进而延缓糖尿病心肌病的发生发展,1,25(OH)2D3干预或可成为糖尿病心肌病防治的新途径。