论文部分内容阅读
背景:扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy,DCM）是一种以心室重塑和心肌纤维化为病理表现的疾病。它主要的临床表现是心室扩大和心脏功能受损。DCM是世界人口死亡的原因之一,也是心脏猝死和心脏移植的重要原因。截止2015年,全球心肌病患病率约为250万,比2005年增加了 27%。DCM是多种因素相互作用的产物。事实上,先天遗传和后天环境都参与了 DCM的发生发展。作为一种遗传异质性疾病,遗传变异约占DCM病例的25%-40%。迄今为止,与DCM有关的基因相继被发现,但这并不能解释全部病例。心脏转录因子主要调控心脏发育过程中的腔室分化和心肌增殖,并通过多种途径影响心脏发育相关基因的表达。因此,心脏转录因子的突变不仅会导致心脏形态缺陷,还会改变心脏功能,从而诱发心脏疾病和心律失常。转录因子TBX20是与心脏正常发育和形态规范有关的重要转录因子之一,主要参与心脏结构和功能的调控。目前已知TBX20与多种心脏疾病有关,包括先天性心脏病和心律失常等心血管疾病。虽然有研究报道TBX20在DCM中异常表达,但尚未有关于TBX20基因启动子区域变异与DCM发生发展的研究。因此,我们推测TBX20基因启动子区域的变异可能改变TBX20基因的表达,从而参与DCM的发病机制。目的:基于TBX20基因启动子在DCM患者中的遗传和功能研究,通过测序确定TBX20基因启动子区的DNA序列变异（DSV）。通过载体构建和细胞转染分析DSVs对TBX20基因启动子功能的影响。通过DNA-蛋白质结合技术探索DSVs影响TBX20基因启动子功能的可能调控机制。旨在为DCM的发生发展提供遗传学基础。方法:1.采用病例对照的研究方法,纳入病例组DCM患者136人,对照组210人。取参与者的空腹血液样本3-4 ml用于基因组DNA提取。2.进入NCBI中的GenB ank数据库,查找TBX20基因启动子DNA序列,设计并合成TBX20基因启动子PCR引物,对启动子进行扩增并测序。3.将测序结果和野生型TBX20基因启动子DNA序列比对,鉴定TBX20基因启动子区的DSVs。4.使用TRANSFAC数据库预测DSVs是否影响了 TBX20基因启动子区转录因子的结合位点。5.将野生型和变异型TBX20基因启动子片段克隆到pGL3-basic表达载体中构建重组质粒。构建成功的pGL3重组质粒和内参质粒pRL-TK被共转染到HEK-293和新生大鼠心肌细胞中（NRCMs）。测定被转染细胞的相对荧光素酶活性,分析结果,判断DSVs对TBX20基因启动子转录功能的影响。6.凝胶迁移率变异实验（EMSA）检测DSVs是否影响了 TBX20基因启动子与转录因子的结合。结果:通过测序,在所有研究对象的TBX20基因启动子中共发现10个DSVs。其中,1个新的DSV（g.4275G＞T）和4个单核苷酸多态性（SNPs）[g.4169G＞A（rs1263874255）,g.4949C＞T（rs119174599）,g.5114G＞A（rs112076877）,g.5252C＞T（rs1356932911）]仅存在于DCM组。1 个SNP[g.4028T＞C（rs186936022）]和 1 个新的DSV（g.4075G＞T）仅在对照组中出现。3 个 SNPs[g.5198G＞A（rs139651523）,g.4740T＞C（rs336284）,g.5295T＞C（rs73099190）]在DCM组和对照组中均存在。其中SNPs[g.4740T＞C（rs336284）和g.5295T＞C（rs73099190）]在DCM组出现的频率均高于对照组（P=0.04,P=0.005）,但SNP[g.5198G＞A（rs139651523）]在两组之间的频率分布差异无统计学意义（P＞0.05）。TRANSFAC预测结果显示SNP[g.4169G＞A（rs1263874255）]可能消除了ZXDA和ZXDB的结合位点,生成了CSX的结合位点。DSV（g.4275G＞T）可能废除了TFIIB 和SMAD1 的结合位点,产生了SMAD5的结合位点。SNP[g.4949C＞T（rs1191745927）]可能生成了 ELF2,ERG和GABP-alpha的结合位点,修饰了 CPBP的结合位点。SNP[g.5114G＞A（rs112076877）]可能破坏了GKLF和PU.1 的结合位点,创造了ZNF35的结合位点。SNP[g.5252C＞T（rs1356932911）]可能破坏了CSX的结合位点,产生了NFAT和EHF的结合位点。转染结果显示,在HEK293细胞和NRCMs中,表达载体[pGL3-4275T、pGL3-4740C+4949T+5295C、pGL3-5114A和pGL3-5252T]显著增强了TBX20基因启动子的转录活性（P＜0.05）。而表达载体[pGL3-4028C、pGL3-4075T和pGL3-4169A]没有改变TBX20基因启动子的转录活性（P＞0.05）。EMSA结果显示,DSV（g.4275G＞T）消除了一个未知转录因子与TBX20基因启动子的结合,增加了一个未知转录因子与TBX20基因启动子的结合。SNP[g.4949C＞T（rs1191745927）]增加了一个未知转录因子与TBX20基因启动子的结合。SNP[g.5114G＞A（rs112076877）]增强了一个未知转录因子与TBX20基因启动子的结合。SNP[g.5252C＞T（rs1356932911）]破坏了一个未知转录因子与TBX20基因启动子的结合。而SNPs[g.4169G＞A（rs1263874255）]没有影响转录因子与TBX20基因启动子的结合。结论:在本研究中发现4个DSVs[g.4275G＞T,g.4949C＞T（rs119174599）,g.5114G＞A（rs112076877）,g.5252C＞T（rs1356932911）]在HEK-293细胞和NRCMs中通过影响了转录因子的结合显著增加了TBX20基因启动子的转录活性。这可能改变了TBX20的表达水平,参与了DCM的发生和发展。我们的发现将改善致病启动子变异的诊断,并有助于我们对转录调控在DCM发生发展中的理解。