研究背景及目的结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势,且疗效仍不乐观。结直肠癌的发生发展分子生物学基础复杂,是一个多步骤、多机制、多基因参与的过程,其中抑癌基因失活是导致其发生的重要因素之一,已知的与结直肠癌发生发展密切相关的抑癌基因有P53、APC、DCC、MMR等。发现和鉴定新的结直肠癌相关抑癌基因将有助于揭示结直肠癌的发病机理、判断预后及指导临床治疗。而导入抑癌基因是肿瘤基因治疗的重要策略,筛选并发现新的抑癌基因可为肿瘤治疗提供新的切入点。X染色体上 Wilms 瘤基因(Wilms Tumor gene on the X chromosome,WTX),又名FAM123B,是在Wilms瘤中发现的首个定位于X染色体的抑癌基因。人WTX基因定位于Xqll.l,全长7.5kb,CDS区长3571bp,编码一个124KD的蛋白。作为WNT/β-catenin通路成员,WTX基因在机体多项正常生理功能和肿瘤发生发展中发挥重要作用。目前的研究显示,WTX的作用主要包括三个方面,首先WTX可以通过改变β-catenin蛋白的稳定性,促进β-catenin的泛素化与降解,负性调节经典的胚胎发育和肿瘤发生相关WNT/β-catenin信号通路,发挥抑癌基因的功能。另外,WTX在质膜调节WNT信号转导中起重要作用;不仅如此,WTX在质膜通过与APC的相互作用控制细胞与细胞间粘附,并在细胞核调节WT1转录因子的活性。另外,WTX基因突变还与硬化性骨病发生有关。本课题组前期广泛检测了 WTX蛋白和RNA在全身多器官肿瘤及配对正常组织中的表达,结果显示WTX除在正常肾组织中高表达外,在结直肠粘膜中也高表达,而结直肠癌中表达明显降低或不表达。提示WTX在结直肠癌中也具有抑癌基因功能,WTX基因失活可能在结直肠癌进展过程中发挥着重要作用。对于WTX基因失活机制的初步探索,本课题组前期研究结果提示,WTX基因缺失/突变和基因启动子区域甲基化均不是导致WTX失活的主要原因。作为21世纪生命科学研究重大发现之一,microRNA(简称miRNA)目前已成为肿瘤研究的热点领域。miRNA是真核生物中一类长度约为19-25个核苷酸,参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA。它通过与靶mRNA完全或不完全的互补配对,促进靶mRNA降解或抑制其蛋白的翻译,在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及疾病的发生中扮演重要的角色。大量的研究资料表明,至少有1/3的人类基因与miRNA调控相关,其中调控抑癌基因功能是miRNA重要作用之一。那么结直肠癌中WTX基因失活是否受miRNA调控?具体是哪些miRNAs?miRNA-WTX调控模式在结直肠癌发生发展中的作用如何,是本课题研究的重要内容。本课题利用miRNA芯片,从结直肠癌及配对正常粘膜组织中筛选出与WTX表达负相关的2个miRNAs(miR-106a及miR-20a),明确二者在结直肠癌增殖、侵袭和转移中的作用。为进一步深入探讨WTX在结直肠癌进展过程中的作用及机制,我们又采用双向电泳联合差异蛋白质谱分析、以及免疫共沉淀验证,寻找结直肠癌细胞中受WTX调控的蛋白,鉴定与WTX相互作用的蛋白,筛选结直肠癌中WTX相关下游信号通路;希望构建结直肠癌中miRNA-WTX-下游作用通路调节途径。主要内容如下:(1)筛选及验证结直肠癌中直接调控WTX基因的miRNAs;(2)阐明miR-106a及miR-20a介导的WTX基因失活对结直肠癌细胞生物学特性的影响;(3)筛选WTX下游调控蛋白,探讨WTX相关信号作用通路;构建并揭示miR-106a/20a-WTX-下游信号通路作用途径的组成和功能。本研究旨在探明结直肠癌中miRNAs在调节WTX表达及结直肠癌进展等方面的作用及意义,最终揭示结直肠癌中WTX失活和作用机制,为深入探讨新抑癌基因WTX功能及机制提供新的依据。再应用蛋白组学方法,从整体上研究WTX的功能作用,并为结直肠癌甚至肿瘤发生发展的机制研究和分子靶向治疗提供新的靶标。研究方法1.结直肠癌组织中调控WTX失活的miRNAs的筛选及验证(1)采用生物芯片初步筛选在结直肠癌组织中调控WTX失活的miRNAs,并利用荧光定量PCR验证结直肠癌组织miRNAs的表达情况。(2)荧光定量PCR检测结直肠癌及配对正常粘膜组织中WTX基因的表达。并结直肠癌中WTX基因的表达及miRNAs的表达进行相关分析。(3)荧光定量PCR及western blot,检测结直肠癌细胞株中WTX及相互作用miRNAs的表达。2.双荧光素酶报告系统检测WTX与miRNAs相互作用关系。扩增包含WTX 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至pGL3-control载体,构建pGL3-control-WTX-3’UTR载体,并对此重组载体进行定点突变构建pGL3-control-WTX-3’UTR-Mut载体。利用双荧光素酶报告系统检测WTX与miRNAs的调控关系。3.miRNAs介导WTX基因失活对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)利用阳离子脂质体法,将miRNAs inhibitor瞬时转染WTX低表达结直肠癌细胞株,利用荧光定量PCR及western blot检测WTX基因的表达;western blot检测EMT相关指标的变化。(2)利用CCK8法,体外侵袭实验和细胞凋亡检测,检测miRNAs抑制前后对结直肠癌细胞增值、凋亡及侵袭能力的影响;(3)miRNAs过表达病毒颗粒感染WTX高表达结直肠癌细胞株,构建稳定过表达细胞株,利用荧光定量PCR及western blot检测WTX基因的表达。(4)利用CCK8法,平板克隆形成和体外侵袭实验,检测miRNAs过表达对结直肠癌细胞增值及侵袭能力的影响;(5)利用整体可视化动物模型,检测miRNAs过表达稳定细胞株对裸鼠皮下成瘤能力的影响。4.结直肠癌中WTX受miRNAs调控失活对下游信号通路影响(1)利用双向电泳及蛋白质质谱分析,筛选出WTX相互作用蛋白,探明下游相关信号通路分子;(2)Western blot检测结直肠癌及正常粘膜组织中WTX下游相关信号通路分子的表达;(3)利用Western blot检测靶点miRNAs inhibitor及过表达转染结直肠癌细胞株中WTX下游相关信号通路分子的表达变化;(4)利用免疫荧光染色检测差异蛋白与WTX的共定位情况;(5)利用免疫共沉淀技术初步验证与WTX相互作用的差异蛋白。5.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。荧光定量PCR结果比较2-ΔΔCt值参与配对样本t检验;Transwell迁移实验、平板克隆形成实验,双荧光素酶活性检测结果均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时采用Welch近似方差分析;方差齐性的多重比较采用LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时采用Dunnett’s T3法。相关性分析,双变量服从正态分布时用Pearson相关分析,不服从时采用Spearman相关分析。CCK8法检测体外增殖实验及皮下瘤体积分析采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.结直肠癌组织中调控WTX失活的miRNAs的筛选及验证(1)5对结直肠癌与配对正常粘膜组织miRNA生物芯片结果提示,93个miRNA在结直肠癌和配对的正常组织中存在表达差异,其中29个在结直肠癌组织中表达上调,64个在癌组织中表达下调。初步选定miR-141,miR-494,miR-492,miR-612,miR-93,miR-20a,miR-106a 等 7 个表达明显上调 miRNAs作为大样本组织验证的靶点。利用荧光定量PCR检测47对结直肠癌组织及正常粘膜组织中上述miRNAs的表达情况。2-ΔΔCt值经配对样本t检验,miR-141及miR-494在16对结直肠癌及正常粘膜组织中的表达均无差异(t= 0.792,P= 0.435;t= 0.959,P= 0.353);在8对结直肠癌组织中miR-492的表达有2对升高,6对降低,统计分析无差异(t=0.876,P = 0.410)。miR-612的表达有4对组织降低,1对组织升高,另外3对组织检测不到其表达。miR-106a,miR-20a在47对结直肠癌中的表达明显高于正常粘膜组织,差异具有统计学意义(t= 3.548,P = 0.001;t= 3.473,P = 0.001)。miR-93 在结直肠癌与正常粘膜组织的表达无差异(t= 1.550,P = 0.128)。(2)WTX基因在54对结直肠癌中的表达明显低于正常粘膜组织,差异具有统计学意义(t=-3.161,P= 0.003)。miR-20a及miR-106a的表达不服从正态分布(Shapio-Wilk法:P<0.001,P<0.001),在47对结直肠癌组织及正常粘膜组织中WTX基因、miR-20a及miR-106a的表达经Spearman相关分析,WTX与miR-20a及miR-106a表达均呈负相关关系,差异具有统计学意义(r=-0.606,P<0.001;r=-0.605,P<0.001)。(3)利用real-time PCR检测miR-106a及miR-20a在6株结直肠癌细胞株中的表达,以SW480细胞为参照,采用单因素方差分析。经方差齐性检验,miR-106a 表达方差齐性(F= 2.178,P= 0.125),miR-20a 表达方差不齐(F=4.254,P=0.019)。结果显示:6种细胞miR-106a/20a的表达差异有统计学意义(F=1611.484,P<0.001;F=777.950,P<0.001),其中 HT29 细胞表达最高;多重比较显示,miR-106a的表达在Lovo与HCT116及LS174t无差异(P=0.864,P=0.575),HCT116 与 LS174tmiR-106a 无差异(P=0.467)。miR-20a 的表达在SW620与HCT116细胞无差异(P=0.062),SW620与LS174t表达无差异(P=0.059),Lovo 与 HCT116 及 LS174t 表达无差异(P=0.944,P=1.000),HCT116与LS174t无差异(P=0.623)。应用western blot检测6株结直肠癌细胞株WTX的表达,WTX在6株结直肠癌细胞株中的表达由高到低依次为SW480,HCT116,Lovo,HT29,SW620,LS174t。结合以上结果,我们选定以 HCT116作为调高miR表达的细胞系,而SW620及LS174t作为下调miR表达的细胞系。2.双荧光素酶报告系统检测WTX与miRNAs相互作用关系。经酶切鉴定及测序成功构建pGL3-control-WTX-3’UTR载体及突变pGL3-control-WTX-3’UTR-Mut 载体。分别将重组、pRL-TK 载体和 miR-20a 及miR-106amimics、NC共转染HEK293A细胞及HCT116细胞中,检测萤火虫荧光素酶值(F)和海肾荧光素酶值(R),以F/R表示相对荧光素酶活性。结果显示,野生型 pGL3-control-WTX-3’UTR 载体、miR-20a 及 miR-106a mimics、NC共转染HEK293A细胞和HCT116细胞,相对荧光素酶活性值方差齐性(F=0.009,P=0.991;F=4.927,P= 0.054)。经统计分析,各组差异均有统计学意义(F= 72.240,P<0.001;F=13.484,P = 0.006),与 NC 组相比,加入 miR-20a及miR-106a mimics的HEK293及HCT116细胞荧光素酶活性均降低,差异均有统计学意义(P<0.001,P<0.001;P=0.003,P=0.005),荧光素酶活性分别降低 63.3%和 58.2%。突变质粒 pGL3-control-MUT-3’UTR 与 miR-20a 及 miR-106a mimics、NC共转染HEK293A细胞和HCT116细胞,相对荧光素酶活性值方差齐性(F= 1.218,P= 0.36;F= 0.045,P= 0.956),统计分析显示差异无统计学意义(F= 0.038,P= 0.963;F= 0.588,P= 0.584)。上述结果表明 miR-20a 及 miR-106a与WTX 3’UTR可发生特异性结合。3.miR-106a及miR-20a介导的WTX基因失活对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)体外miR-106a及miR-20a抑制实验①将miR-106a及miR-20a inhibitor瞬时转染LS174t及SW620细胞,采用real-time PCR检测miR-106a及miR-20a的表达,结果显示miR-106a及miR-20a的表达明显降低,差异具有显著的统计学意义(F=3470.989,P<0.001;F= 1664.453,P<0.001),说明成功抑制miR-106a及miR-20a的表达;Western blot结果显示,LS174t及SW620细胞在转染miR-106a及miR-20a inhibitor后WTX蛋白的表达明显上调。②利用CCK8法检测结直肠癌细胞LS174t及SW620的增殖能力,提示LS174t和SW620细胞生长时间水平差异具有统计学意义(F=366.119,P<0.001;F=275.854,P<0.001);组间增殖能力差异具有统计学意义(F= 35.31,P<0.001;F= 137.132,P<0.001);时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=10.904,P<0.001;F=35.684,P<0.001)。3组细胞间同一天测得数据经单因素方差分析或Welch法近似方差分析,LS174t及SW620细胞从第四天,各时间细胞组间差异具有统计学意义(均为P<0.001)。③采用Transwell小室的方法检测LS174t及SW620细胞转染miR-106a及miR-20a inhibitor后细胞体外迁移能力的变化,LS174t及SW620组细胞方差齐性检验(F= 6.168,P = 0.014;F= 3.570,P = 0.610)。进行单因素方差分析,LS174t及SW620细胞株中miR-106a及miR-20ainhibitor组穿膜细胞数均少于NC组,细胞间迁移能力差异具有统计学意义(F=122.740,P<0.001;F= 641.853,P=0.000)。上述实验结果表明转染了 miR-106a及miR-20a inhibitor后抑制了结直肠癌细胞LS174t和SW620的迁移能力。④采用 MuseTM Cell Analyzer 检测 LS174t 及 SW620 细胞转染 miR-106a 及miR-20a inhibitor后凋亡细胞的百分比。LS174t及SW620细胞转染miR-106a inhibitor后。LS174t及SW620细胞转染miR-106a inhibitor后,经单因素方差分析,凋亡细胞的百分比下降;转染miR-20ainhibitor后,凋亡细胞百分比增高,差异均具有统计学意义(F=2637.734,P<0.001;F=87.097,P<0.001)。(2)体外miR-106a及miR-20a过表达实验①构建稳定miR-106a及miR-20a过表达HCT116细胞株,荧光定量PCR检测HCT116细胞NC组、miR-106a过表达组和miR-20a过表达组中miR-106a和miR-20a,经独立样本t检验,miR-106a和miR-20a的表达均高于NC组,差异具有统计学意义(t= 100.035,P<0.001;t= 23.262,P<0.001)。WTX 基因在HCT116细胞NC组、miR-106a过表达组和miR-20a过表达组的表达均降低,差异具有统计学意义(t=-42.647,P<0.001;t=-20.302,P= 0.000)。Western blot结果显示,与NC组相比,HCT116细胞WTX蛋白的表达明显上调。②采用CCK8比色法检测HCT116细胞NC组、miR-106a过表达组和miR-20a过表达组的体外增殖能力,3个组的生长时间水平差异具有统计学意义(F =149.400,P<0.001);组间增殖能力差异具有统计学意义(F=58.208,P=P<0.001);时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=7.851,P<0.001)。3组细胞间同一天测得数据经单因素方差分析或Welch法近似方差分析,HCT116细胞除第1天(P =0.182,P =0.230)外,各时间细胞组间差异具有统计学意义(均为P<0.05);③利用平板克隆形成实验检测HCT116细胞NC组、miR-106a过表达组和miR-20a过表达组细胞体外增殖能力的变化。3组的克隆形成率分别为1%、8%、23%。经单因素方差分析,miR-106a过表达组和miR-20a过表达组方差齐性(F=4.634,P=0.061);三组差异具有统计学意义(F=56.573,P<0.001),与NC组相比,miR-106a过表达组和miR-20a过表达组平板克隆形成率增高(P<0.001;P= 0.019)。④采用Transwell小室的方法检测NC组,miR106a过表达组及miR-20a过表达组细胞体外迁移能力的变化,经单因素方差分析,方差齐性(F=2.086,P=0.167);各组差异具有统计学意义(F=356.380,P<0.001);与NC组相比,miR106a过表达组及miR-20a过表达组迁移能力均增高(P<0.001,P<0.001)。上述实验结果表明过表达miR106a及miR-20a促进结直肠癌细胞HCT116的迁移能力。⑤Western blot结果显示,与NC组相比,HCT116细胞WTX蛋白的表达明显上调。(3)体内miR-106a及miR-20a过表达实验将HCT116 NC组,HCT116 miR-20a,HCT116 106a组细胞分别接种裸鼠皮下,接种后第五天开始肉眼可见皮下肿瘤形成,整体成像仪观察瘤体可见明显绿色荧光,23天后处死裸鼠摘除皮下肿瘤。肿瘤体积按照公式v=ab2/2计算,3组皮下瘤的生长时间水平差异具有统计学意义(F=62.088,P<0.001);组间瘤体体积增殖能力差异具有统计学意义(F=33.760,P<0.001);皮下瘤时间与细胞组间交互效应差异有统计学意义(F=3.662,P<0.001)。3组皮下瘤体积同一天测得数据经单因素方差分析,除第5天(P=2.828,P=0.111)外,各组皮下瘤体积差异均具有统计学意义(均为P<0.05);各时间组内皮下瘤体积差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。3.结直肠癌中WTX受miRNAs调控失活对下游信号通路影响利用双向电泳及质谱分析,在过表达WTX稳定细胞株SW620W+及对照细胞中,筛选出表达差异蛋白共50个,其中26个表达下调,24表达上调。我们初步验证了其中表达明显上调的蛋白Rho GDIa的功能,应用western blot检测Rho GDIa在结直肠癌及正常粘膜组织,结果显示Rho GDIa与WTX表达一致,即在结直肠癌中低表达,正常粘膜组织中高表达。转染miR-106a及miR-20a inhibitor的LS174t和SW620细胞中,Rho GDla表达升高;在过表达miR-106a及miR-20a的HCT116细胞中的Rho GDla表达下调。利用免疫荧光染色检测WTX及和Rho GDlα蛋白在结直肠癌SW620W+和对照SW620N1细胞中的表达。结果显示,在SW620W+细胞中,WTX表达强度高于SW620N1细胞;其中WTX定位于胞核及胞浆,Rho GDIα定位于胞浆,二者呈共定位表达。将抗WTX抗体分别与SW620W+和SW620N1细胞细胞总蛋白进行免疫共沉淀,收集免疫共沉淀复合物进行SDS-PAGE分离,经考马斯亮蓝染色分析。结果发现,与对照组相比,SW620W+细胞在35KD附近检测到Rho GDIa差异条带。研究结论1.结直肠癌中miR-106a及miR-20a过表达介导WTX基因失活,促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和转移;2.WTX基因失活可以抑制Rho GDIa蛋白表达;3.通过miR-106a/20a-WTX/Rho GDIa负性调节通路,导致抑癌基因WTX失活,在促进结直肠癌进展方面发挥重要作用。本课题创新之处1.首次发现在结直肠癌中抑癌基因WTX失活受miR-106a及miR-20a调控;2.提出WTX蛋白失活通过影响下游Rho GDIa信号通路促进结直肠癌发生发展的新机制。