脑卒中是中枢神经系统急性脑血流循环障碍性疾病,被世界公认是第三大致死性疾病,具有高发病率、高致残率及高死亡率的特征。在我国,脑卒中系第一位的死亡原因,发病率排名第一。在脑卒中发病人群中,其中缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的60%-70%,是脑卒中的主要类型。虽然缺血性脑卒中发病率如此之高,但是目前临床上对于缺血性脑卒中的治疗手段仅限于血管内经美国食品和药品管理局批准的重组人组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)的溶栓治疗。尽管已将溶栓治疗的时间窗已经扩大到了4.5h,即使在医疗和经济发达的美国,也仅有22%的缺血性卒中病人能够在3h内进到医院急诊,而这些病人中,也只有8%适合rt-PA溶栓治疗。rt-PA的溶栓治疗具有出血风险的副作用,而且更为主要的是治疗时间窗的限制,使得缺血性脑卒中目前的治疗仍缺乏令人满意的治疗效果及干预措施。因此,近年来将研究的目光投向内源性神经保护机制(干预措施)和生物分子标记物。脑缺血损伤是一种复杂的病理生理过程,其中神经元损伤程度及其挽救手段直接决定了缺血性脑卒中的预后。缺血性脑卒中发生后,缺血核心区(core)急性缺血低氧,导致大量神经元出现急性不可逆性坏死,而梗死周围区(peri-infarct area),或称半影区(penumbra),由于侧支循环的血供一定程度上维持了神经元的代谢和细胞内信号转导功能,因此梗死周围区神经元死亡以程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)为主要特征,梗死周围区的损伤神经元是可以挽救的,且其命运直接与缺血性脑卒中的愈后成正相关。因此,我们将研究的注意力集中于减少梗死周围区神经元程序性死亡上面,进一步探讨缺血性脑卒中最有效的治疗方法。本实验室既往应用小鼠建立脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致缺血性脑卒中模型,发现脑内源性蛋白激酶Cγ(classical protein kinase C gamma,c PKCγ)蛋白表达量与MCAO诱导的缺血性脑卒中小鼠脑梗死体积呈明显的负相关,且神经功能损伤程度随着脑内c PKCγ蛋白表达水平的增高而明显减轻,说明脑内源性c PKCγ蛋白表达水平可影响缺血性卒中鼠脑梗死体积和神经功能损伤程度,进一步表明c PKC?在缺血脑组织中发挥着脑保护作用。为了进一步探讨脑内源性c PKC?参予缺血损伤信号转导通路,从整体动物水平,我们利用c PKCγ基因敲除(c PKCγ-/-)小鼠建立1h MCAO/再灌(reperfusion,R)1-7d缺血性脑卒中模型,在整体动物水平明确c PKC?在神经元自噬中的作用;从离体细胞水平,利用c PKCγ-/-小鼠建立1小时氧-糖剥夺/复糖复氧24小时(1h oxygen-glucose deprivation/reoxygenation 24h,1h OGD/R 24h)离体细胞缺血模型,进一步明确c PKC?在神经元缺血损伤中作用及其调制细胞自噬的信号转导机制。动物实验分组包括:正常对照组(Na?ve)、假手术组(Sham)、1h MCAO/R 1-7d模型组、术前5min侧脑室注射自噬流抑制剂巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf A1)后进行1h MCAO/R 3d组、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)对照组。运用神经行为学测试、尼氏(Nissl)染色和2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium,TTC)染色等方法,评价c PKC?对MCAO小鼠神经功能损伤程度、梗死周围区神经细胞数量及脑梗死体积的影响;应用蛋白免疫印记(Western blot)技术,检测c PKC?对1h MCAO/R 1-7d鼠脑梗死周围区皮层神经元自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)-II/(LC3-I+LC3-II)比值的影响,并进一步检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)通路相关蛋白Akt(Ser473)、m TOR(Ser2448)和S6(Ser235/236)的磷酸化水平,探讨c PKC?对MCAO小鼠脑梗死周围区皮层神经元自噬及其Akt-m TOR通路的影响;在c PKCγ野生(c PKCγ+/+)和c PKCγ-/-小鼠MCAO手术前5min进行侧脑室注射Baf A1(2.5g/kg)抑制自噬流,利用Nissl染色方法检测梗死周围区神经细胞数量的变化来进一步评价自噬对缺血性卒中鼠预后的影响。在细胞水平上,选用24 h内出生的C57BL/6J乳鼠,取脑皮质进行原代神经元培养7d后,进行1h OGD/R 24h;在c PKCγ+/+和c PKCγ-/-培养神经元加入Baf A1(100n M)抑制自噬流;在c PKCγ-/-培养神经元加入c PKC?慢病毒表达载体恢复c PKCγ的蛋白表达。实验分组包括:常氧组(Normoxia)、1h OGD/R 24h组、Baf A1(100n M)组及DMSO组、c PKC?慢病毒感染组及其对照组。借助3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTS)比色法检测神经元的存活率,乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测神经元死亡率;应用Western blot法检测Beclin-1蛋白水平和LC3-II/(LC3-I+LC3-II)的比值,检测蛋白Akt(Ser473)、m TOR(Ser2448)和S6(Ser235/236)的磷酸化水平,从而进一步明确c PKC?对1h OGD/R 24h神经元自噬及其Akt-m TOR通路的影响。实验数据统计利用SPSS 11.5统计软件,采用单因素方差分析(One Way ANOVA)进行统计学处理,组间两两比较采用Bonferroni检验,结果以均数±标准误(X±S.E.)表示,差异显著性水平p<0.05,p<0.01,p<0.001。实验结果如下:1.c PKC?基因敲除增大缺血性卒中鼠脑梗死体积为明确c PKC?对缺血性卒中鼠脑局部脑血流(cerebral blood flow,CBF)的影响,在MCAO手术过程中对小鼠进行局部脑血流监测,在正常情况下,以小鼠局部CBF为100%,MCAO术后局部CBF下降到20%左右,而在1h MCAO后拔除线栓,小鼠局部CBF又重新恢复到100%左右正常水平,在c PKCγ-/-小鼠,同样的处理情况下局部CBF呈现与c PKCγ+/+小鼠同样的变化情况,且两者之间并无统计学意义。说明c PKCγ不影响MCAO术后小鼠局部CBF的变化。为明确c PKC?对缺血性卒中鼠脑梗死体积的影响,小鼠脑组织切片,TTC染色结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P=0.004)脑梗死体积明显增大(每组n=5)。结果表明,c PKCγ基因敲除增大缺血性卒中小鼠脑梗死体积,且不是CBF变化引起。2.c PKC?基因敲除加重缺血性卒中鼠脑神经功能损伤为检测c PKC?对缺血性卒中鼠脑神经功能损伤的影响,对小鼠进行神经功能测试。神经行为学评分结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P=0.039)神经功能评分明显增高(每组n=5);爬杆实验(Pole Test)结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P=0.007)、3d(P<0.001)和7d(P=0.001)在转身180°头朝下所用时间(Tturn)明显延长;与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P=0.002)到达地面所用时间(Ttotal)明显延长。挂线实验(Wire Hanging)结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P<0.001)在线绳上停留时间(Latency to fall)明显减短。圆柱体实验(Cylinder Test)结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d((P<0.001)右侧损伤前肢探寻次数(Score)明显减少。前肢偏好实验(Handedness Test)结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P=0.005)右侧损伤前肢偏性指数(Laterality Index)明显减少。步错实验(Foot Fault Test)结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P=0.001)和7d(P=0.009)右侧损伤肢体踏空次数(Contralateral Foot Fault)明显增多(每组n=6)。以上结果均表明,c PKC?基因敲除加重缺血性卒中鼠脑神经功能损伤。3.c PKC?基因敲除增加缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞丢失为检测c PKC?对缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞数量的影响,脑组织冰冻切片,Nissl染色结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 3d梗死周围区神经细胞丢失明显加重(P<0.001,每组n=5)。结果表明,c PKC?基因敲除加重缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞丢失。4.c PKC?通过Akt-m TOR通路影响缺血性卒中鼠脑梗死周围区自噬水平为探讨c PKCγ对缺血性卒中鼠脑梗死周围区自噬水平的影响,蛋白免疫印迹结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P<0.001)梗死周围区内Beclin-1蛋白水平明显增高(每组n=7)。同样,与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 1d(P<0.001)、3d(P<0.001)和7d(P=0.005)LC3-II/(LC3-I+LC3-II)比值明显增高(每组n=7)。为了进一步探讨c PKCγ对缺血性卒中鼠脑梗死周围区自噬水平的影响是否通过Akt-m TOR通路,蛋白免疫印迹结果显示:与c PKCγ+/+小鼠相比,c PKCγ-/-小鼠经1h MCAO/R 3d后,梗死周围区内Akt(Ser473)、m TOR(Ser2448)和S6(Ser235/236)磷酸化水平下降更为明显(P<0.001,每组n=5)。以上结果提示,c PKC?基因敲除增高缺血性卒中鼠脑梗死周围区Beclin-1蛋白水平和LC3-II/(LC3-I+LC3-II)比值可能是通过下调Akt-m TOR通路的磷酸化水平。5.Baf A1抑制自噬流对缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞数量的影响为明确Baf A1能够成功抑制缺血性卒中鼠脑梗死周围区自噬流,蛋白免疫印迹结果显示:与DMSO组相比,自噬体和溶酶体结合抑制剂Baf A1(0.25mg/kg)不能使c PKCγ+/+和c PKCγ-/-小鼠在1h MCAO/R 3d脑梗死周围区LC3-II聚集(每组n=5),而Baf A1(2.5mg/kg和25mg/kg)明显引起c PKCγ+/+和c PKCγ-/-小鼠在1h MCAO/R 3d梗死周围区LC3-II聚集(P<0.001,每组n=5),提示Baf A1(2.5mg/kg和25mg/kg)可成功抑制自噬流,因此,选Baf A1(2.5mg/kg)作为下一步实验中剂量。为明确Baf A1抑制自噬流对缺血性卒中鼠脑梗死周围区神经细胞数量的影响,脑组织冰冻切片,Nissl染色结果显示:与DMSO组相比,c PKCγ+/+小鼠,Baf A1(2.5mg/kg)加重1h MCAO/R 3d鼠脑梗死周围区神细胞丢失(P<0.001,每组n=5),而对于c PKCγ-/-小鼠,Baf A1(2.5 mg/kg)减轻1h MCAO/R 3d鼠脑梗死周围区神经细胞丢失(P<0.001,每组n=5)。结果表明,c PKCγ可通过调制缺血性卒中鼠脑梗死周围区自噬水平影响缺血性卒中鼠脑损伤程度。6.c PKC?通过Akt-m TOR通路影响缺血神经元自噬水平为探讨c PKCγ对缺血神经元存活率和死亡率的影响,MTT实验结果显示:与c PKCγ+/+神经元相比,c PKCγ-/-神经元经1h OGD/R 24h存活率明显下降(P<0.001,每组n=6);LDH实验结果显示:与c PKCγ+/+神经元相比,c PKCγ-/-神经元经1h OGD/R 24h死亡率明显升高(P<0.001,每组n=6)。为探讨c PKCγ对缺血神经元自噬水平的影响,蛋白免疫印迹结果显示:与c PKCγ+/+神经元相比,c PKCγ-/-神经元经1h OGD/R 24h处理Beclin-1蛋白水平明显增加(P<0.001,每组n=6),同样,与c PKCγ+/+神经元相比,c PKCγ-/-神经元经1h OGD/R 24h处理LC3-II/(LC3-I+LC3-II)比值明显增加(P<0.001,每组n=6)。为了进一步探讨c PKCγ对缺血神经元自噬水平的影响是否通过Akt-m TOR通路,蛋白免疫印迹结果显示:与c PKCγ+/+神经元相比,c PKCγ-/-神经元经1h OGD/R 24h神经元内Akt(Ser473)、m TOR(Ser2448)和S6(Ser235/236)的磷酸化水平下降更为明显(P<0.001,每组n=6)。以上结果表明,c PKC?基因敲除降低缺血神经元存活率,与其调制Akt-m TOR通路增高缺血神经元自噬水平有关。7.Baf A1抑制自噬对缺血神经元存活率和死亡率的影响为明确Baf A1能够成功抑制自噬流,蛋白免疫印迹结果显示:与DMSO组相比,Baf A1(100m M)明显使神经元经1h OGD/R 24h处理LC3-II/(LC3-I+LC3-II)比值升高(P<0.001,每组n=6)。为明确Baf A1抑制自噬流对缺血神经元存活率和死亡率的影响,MTT实验结果显示:与DMSO组相比,经1h OGD/R 24h处理c PKCγ+/+神经元,Baf A1(100n M)使其存活率下降更为明显(P<0.001,每组n=6),而对于1h OGD/R 24h处理c PKCγ-/-神经元,Baf A1(100n M)使其存活率下降显著降低(P<0.001,每组n=5);LDH实验结果显示:与DMSO组相比,经1h OGD/R 24h处理c PKCγ+/+神经元,Baf A1(100n M)使其死亡率显著增加(P<0.001,每组n=6),而对于1h OGD/R 24h处理c PKCγ-/-神经元,Baf A1(100n M)使其死亡率显著降低(P<0.001,每组n=6)。以上结果表明,c PKCγ可通过调制缺血神经元自噬水平影响神经元缺血损伤。8.恢复c PKC?蛋白表达可降低缺血神经元自噬水平提高存活率我们利用慢病毒载体(LV)-c PKC?转染c PKC?-/-神经元恢复c PKC?蛋白表达后,再进行1h OGD/R 24h缺血处理。蛋白免疫印迹结果显示:与LV-c PKC?(-)相比,转染(LV)-c PKC?组Beclin-1蛋白表达水平及LC3-II/(LC3-I+LC3-II)比值显著降低(P<0.001,每组n=6);同时,MTT实验结果显示:与LV-c PKC?(-)相比,转染(LV)-c PKC?组神经元存活率明显提高(P<0.001,每组n=6);LDH实验结果显示:与LV-c PKC?(-)相比,转染(LV)-c PKC?组神经元死亡率明显下降(P<0.001,每组n=6)。结果表明,恢复c PKCγ蛋白表达提高缺血神经元存活率可能与其自噬水平降低有关。综上所述,本实验利用MCAO缺血性脑卒中小鼠模型和OGD神经元离体缺血模型,发现c PKCγ可能通过调制神经元内Akt-m TOR通路介导的自噬减轻缺血性卒中鼠脑缺血损伤。所获成果将进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤机制认识的同时,可为临床防治缺血性脑卒中提供实验依据。