论文部分内容阅读
中华根瘤菌(Sinorhizobium)是一类好氧异养型革兰氏阴性细菌,能够与豆科植物共生固氮,是土壤中常见的一类菌群。目前,’国内外对中华根瘤菌的研究主要集中在与植物共生的关系、制作根瘤菌剂、提高固氮效率和环境修复方面,也有报道发现某些菌株能够产生VB12。本实验室分离获得一株能够产生VB12的菌株,通过16SrDNA测序鉴定,该菌株属中华根瘤菌属(S.sp.),是一个全新的菌株,命名为kd23。培养过程中发现,该菌除了产生VB12之外,细胞还有大量聚羟基丁酸(PHB)积累。PHB颗粒在发酵前期大量积累,后期部分分解,与VB12的合成似乎存在一定联系。因此,研究二者的内在联系,有重要的理论价值。我们推测,阻断PHB的合成,细胞积累3-羟基丁酰辅酶A,可能有效提高VB12的合成产量。利用常规发酵条件调查和工艺优化方法初步研究了菌株kd23的生长和VB12发酵过程。确定其发酵最适碳源为麦芽糖；氮源为玉米浆和甜菜碱；糖浓度维持在20g/L有利于提高VB12的产量；钴离子在发酵过程中有决定性的作用。优化后的发酵周期,192 h,VB12的产量达到120 mg/L。利用分子生物学方法和基因操作技术克隆了PHB合成过程中关键酶——PHB合成酶基因phbC。通过常规PCR和不均一PCR,得到了1859 bp的phbC基因片段,与苜蓿中华根瘤菌(S. meliloti Rm41)一致性84%。应用分子生物学技术构建了含有phbC基因同源臂和氯霉素抗性基因的整合载体pPHBCAT质粒,为失活中华根瘤菌phbC基因提供了材料。关于该菌株的分子生物学研究尚未见报道,为研究PHB颗粒与VB12之间的关系,我们建立了S. sp. kd23遗传转化系统。通过抗生素敏感性验证实验,确定10μg/L氯霉素可以用于S. sp. kd23的筛选。应用含phbC上下游同源臂和氯霉素抗性基因的PCR产物进行电击转化,结果表明,在25μF,200 Ω,2.2 kV,2 mm电转杯的条件下,得到了13个克隆子。PCR鉴定结果表明,我们获得了phbC基因沉默的转化子。