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豆象科Bruchidae昆虫主要取食豆类的种子,以幼虫在豆粒内钻蛀为害,是一类具有重要经济意义的仓储害虫。目前在我国分布广泛、危害性大的豆象科昆虫主要有三种:豆象属Bruchus的蚕豆象Bruchus rufimanus Behoman和豌豆象Bruchus pisorum(Linnaeus),以及瘤背豆象属Callosobruchus的四纹豆象Callosobruchus maculatus(Fabricius),其中四纹豆象是我国进境植物检疫性有害生物之一。因此,开展该类害虫的研究具有重要意义。
本文对上述3种豆象科昆虫不同地理种群线粒体DNA(mtDNA)的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因、细胞色素b脱辅基酶(Cytb)基因进行测序,并结合网上发布的该类昆虫的有关COI和Cytb基因序列,对其不同地理种群和种间亲缘关系进行探讨;同时,根据已测mtDNA COI基因序列设计了两套用于快速鉴定四纹豆象及其近缘种的特异性引物,并对该引物检测的灵敏度和稳定性进行了研究,其主要结果如下:
1、通过实验,筛选出一种较稳定,且能大规模在实验室条件下提取豆象不同种类基因组DNA的方法,即CTAB法。经过OD值的测定和扩增实验,证明了该方法得到的DNA样品完全可以满足PCR引物扩增要求。通过对比酒精浸泡、阴干和烘干三种保藏方法豆象标本的提取结果表明,该方法可以用于酒精浸泡和烘干保存标本的基因组DNA的提取,且有较好的提取效果;但对阴干保藏标本的提取效果差。
2、豆象科部分种类mtDNACytb(12种)和COI(13种)基因序列的分析表明,这两种基因表现出强烈的A+T偏向,分别为69.8％和66.8％,第三位A或T的偏好更加明显,均为85.0％。核苷酸的替代转换明显高于颠换,颠换的发生主要以A/T为主,大都发生在密码子第三位。密码子第3位点的高A+T含量与氨基酸的变异存在一定的相关性。密码子以A,T结尾频率高,第三位是G的密码子使用较少,反映出Cytb和COI基因在密码子的使用上具有偏向性。用两种建树方法(距离法和最简约法),基于COI和Cytb基因构建的豆象科部分种类的系统树的拓扑结构基本一致,同属的种类分别聚在一起。
3、从上述三种豆象不同地理种群mtDNA基因(COI、Cytb)的单倍型和分布格局来看,各地理种群中很少有独享单倍型存在,说明种群间的遗传分化程度较低;基于2个基因的地理种群间的基因流显示,各种群间既存在着一定数量的基因交流,也存在一定程度的遗传分化。豌豆象不同地理种群间的COI基因和Cytb基因的遗传分化研究表明,Cytb基因江苏种群与甘肃种群间Nm值小于1,而COI基因Nm值大于1,可见豆象的Cytb基因进化速度比COI基因快。COI和Cytb基因都是研究蚕豆象、豌豆象和四纹豆象地理种群的遗传分化的良好分子标记。
4、根据已测mtDNACOI基因序列设计了两套用于快速鉴定豆象种类的特异性引物,一套用于从多种豆象中快速鉴定出四纹豆象,另一套用于鹰嘴豆象和四纹豆象两个近缘种之间的分子鉴定,并用特异性内切酶实验作进一步验证。结果显示两套引物都具有较高的检测灵敏度和稳定性,解决了四纹豆象及其近缘种之间形态相似难以鉴定的难题,适合检验工作中大样本的检测,并且不要求标本的完整性,也可以对豆象不同虫期进行检测和鉴定。