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青霉素酶是催化水解青霉素β-内酰环产生青霉噻唑酸的一类β-内酰胺酶。目前,市场上大部分乳制品企业在牛奶中人为的添加青霉素酶,以达到降解青霉素类抗生素的目的,降低青霉素类药物的残留含量。但牛奶中蓄积的青霉素酶对人体危害很大,是禁止使用的食品添加剂。因此,对牛奶中青霉素酶的快速识别的研究势在必行。本研究选用青霉素酶(TEM-1)为因子,免疫健康实验獭兔,制备出针对青霉素酶的特异性抗血清,采用间接ELISA法对制备的特异性抗血清进行评价,并对特异性抗血清进行纯化,利用效价最高的特异性抗血清制备免疫亲和层析柱,建立识别牛奶中青霉素酶的方法。具体内容与结果如下:1.用青霉素酶(TEM-1)为抗原,按照常规免疫方法免疫健康实验獭兔,制备出针对青霉素酶的特异性抗血清。同时建立间接ELISA方法,其中包被抗原青霉素酶(TEM-1)的工作浓度为10μg/ml,阴性血清的工作浓度为1:2000倍稀释,HRP-山羊抗兔IgG二抗的最佳稀释倍数为1:2000,抗原最佳包被条件为4℃过夜,血清最佳反应时间为37℃1h,酶标二抗反应最佳时间为37℃1h,底物作用的最佳时间为20min。制备的青霉素酶特异性抗血清的最高效价为1:6.4×10~4。2.将制备的青霉素酶特异性抗血清用饱和硫酸铵粗提,然后用DEAE-Sephadex A 50凝胶层析柱进一步纯化IgG,经PAGE-SDS电泳法鉴定为目标蛋白。同时将纯化的IgG与CNBr-Sepharose 4B偶联,计算得出偶联率为92%,继续制备免疫亲和层析柱。3.建立检测青霉素的毛细管电泳(HPCE)检测方法,绘制标准曲线,线性方程为y=2698.7x-2330.2,R2=0.9991。最低检测限为2μg/mL。建立青霉素与青霉素酶对应关系的标准曲线,线性方程为y=-1071.1x+1126.1,R~2=0.9699。测得免疫亲和层析柱动态柱容量为2041ng/mg,绝对柱容量为410.98ng/mg。分别添加5mL 200μg/mL、300μg/mL和400μg/mL青霉素酶标准工作液,5mL甲醇洗脱,高效毛细管电泳检测,连续测定6次,测得其回收率为91%、93.33%、95.5%,变异系数为5.12%、3.31%、3.75%。同时测得牛奶中青霉素酶的浓度为0.378μg/mL。以上结果表明:本研究成功地制备了青霉素酶(TEM-1)特异性抗血清,建立了青霉素酶(TEM-1)特异性抗血清间接ELISA检测方法。青霉素酶特异性抗血清进行纯化后,成功地制备了特异性吸附青霉素酶(TEM-1)的免疫亲和层析柱,并对免疫亲和层析柱的柱效进行了评价。成功地建立了检测青霉素酶(TEM-1)的高效毛细管电泳方法。牛奶样品经过免疫亲和层析柱前处理后,应用建立的高效毛细管电泳方法检测,效果好。