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目的：[1] 以人乳头瘤病毒(HPV)6b型结构蛋白L1为抗原释放系统的载体,携带HPV 16型早期蛋白E7细胞毒T细胞(CTL)表位,克隆HPV6bL1/16E7 CTL表位的嵌合基因,并通过真核表达载体pcDNA3.1(+)构建嵌合核酸疫苗HPV6bL1/16E7 CTL.[2] 将该重组的嵌合核酸疫苗转染COS-7细胞,观察细胞病变后,将细胞裂解提取蛋白,SDS-PAGE分析蛋白条带的分子量,并经Westem blot分析鉴定构建的重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL/16E7 CTL能在哺乳动物细胞表达目的蛋白.该重组真核表达质粒(即嵌合核酸疫苗HPV6bL1/16E7 CTL)的构建为进一步研究其在动物体内的免疫效应奠定了基础.
方法：[1] 设计了能同时扩增.HPV6b L1与HPV 16E7 CTL表位的PCR.引物,并在两端设计酶切位点.通过基因克隆方法将PCR产物片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆位点中,构建成重组真核表达质粒,并经酶切和测序分析进行鉴定.[2] 用Polyfect非脂质体转染试剂盒将经鉴定的重组质粒转染至COS-7细胞,通过SDS.PAGE和Westem blot分析所表达的蛋白.
结果：[1] 经酶切和测序鉴定,证实获得了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/16E7 CTL.[2] 转染哺乳细胞COS-7后,裂解细胞提取蛋白,SDS-PAGE显示出现了与预测一致的分子量为.56KDa的蛋白条带,并经Western blot分析鉴定,证实为特异性的目的蛋白,表明构建的嵌合核酸疫苗在真核细胞内成功表达了该嵌合蛋白.
结论：
[1] 成功构建了pcDNA3.1(+)/HPV6bL1/16E7 CTL表位嵌合基因真核表达质粒(即HPV6bL1/16E7 CTL表位嵌合核酸疫苗).
[2] 证实该重组核酸疫苗可以在哺乳细胞中表达嵌合蛋白,为研究HPV 6bL1/16E7 CTL表位嵌合核酸疫苗的免疫效应奠定了实验基础.