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急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是由多种致病因素造成的肺实质细胞出现严重炎症反应,导致肺通透性增高、发生急性肺水肿的结果。由于失血性休克引起的微循环障碍以及肺的血流动力学特点,使得失血性休克患者最易发生ALI,可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),严重危及患者生命。我室前期研究发现,减少肠淋巴液回流,可减轻肺损伤,在降低肺组织氧化应激的同时,降低了肺组织Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)、TLR4的表达以及高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box1,HMGB1)的表达。研究表明,失血性休克后,活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量产生与释放,通过激发组织机体的炎性反应、介导细胞凋亡及增加血管通透性等方面导致ALI。但失血性休克后肠淋巴液(post-hemorrhagic shock mesenteric lymph,PHSML)介导ALI过程中是否有ROS的参与,尚不清楚。减少PHSML回流是否可降低肺组织ROS的产生与释放,PHSML介导肺组织ROS的产生与释放是否受TLR2、TRL4、HMGB1的影响(和/或影响TLR2、TLR4、HMGB1的表达)?有待研究。因此,本文在前期研究基础上,采用失血性休克小鼠模型,观察PHSML引流对失血性休克小鼠肺组织结构以及ROS含量变化的影响,观察静脉回输PHSML是否引起小鼠(野生型、TLR2-/-、TLR4-/-)肺组织结构损伤、ROS产生与释放及TLR2、TLR4分子表达,并进一步从细胞层面观察ROS抑制剂(NAC)、TLR2及TLR4封闭性抗体处理小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)后,PHSML对PMVECs产生ROS的影响,从而验证PHSML是肺组织ROS产生增多的作用因素之一,该作用是通过TLR2、TLR4、HMGB1介导的。首先,将野生型(WT)C57BL/6J小鼠18只随机均分为假手术组(Sham)、失血性休克组(Shock)、休克+引流组(Shock+drainage)组;常规方法建立失血性休克模型,观察PHSML对失血性休克小鼠肺组织形态与ROS含量的作用。结果显示,Sham组小鼠肺组织结构基本正常;Shock组小鼠肺组织严重破坏,间隔增宽,多见炎性渗出及出血,肺泡腔大量融合;Shock+drainage组小鼠肺组织损伤较轻。同时可见,失血性休克引起了小鼠肺组织ROS显著增高,PHSML引流显著降低了Shock组小鼠肺组织ROS含量。随后,应用TLR2-/-、TLR4-/-小鼠各12只,均分为Sham、Shock组,常规方法建立失血性休克模型,观察TLR2、TLR4基因敲除对失血性休克小鼠肺组织形态与ROS含量的作用。结果显示,TLR2-/-、TLR4-/-的Shock组小鼠肺组织肺间隔炎性物质渗出,间隔增宽,肺泡部分融合,但程度较WT小鼠低,且肺组织ROS含量均显著低于WTShock组小鼠。然后,应用50只WT小鼠,引流正常淋巴液(normal mesenteric lymph,NML)和PHSML(与前述相同的失血性休克模型),分别静脉输入至WT、TLR2-/-、TLR4-/-小鼠,每组6只,观察静脉输入PHSML对各型小鼠肺组织形态、ROS含量以及TLR2、TLR4 mRNA表达的影响。结果显示,静脉输入NML对WT、TLR2-/-、TLR4-/-小鼠肺组织结构无明显影响,静脉输入PHSML引起了WT正常小鼠出现了比较严重的肺组织损伤,而静脉输入PHSML对TLR2-/-、TLR4-/-小鼠肺组织损伤的程度较轻。同时可见,静脉输入PHSML引起了WT正常小鼠肺组织ROS含量以及TLR2、TLR4的mRNA表达显著高于输入NML组;静脉输入PHSML至TLR2-/-、TLR4-/-小鼠的肺组织ROS含量显著低于WT小鼠,高于输入NML的同型小鼠;静脉输入PHSML至TLR4-/-小鼠肺组织的TLR2 mRNA表达显著高于输入NML的TLR4-/-小鼠以及输入PHSML的WT小鼠;同样,静脉输入PHSML至TLR2-/-小鼠肺组织的TLR4 mRNA表达显著高于输入NML的TLR2-/-小鼠以及输入PHSML的WT小鼠。为了进一步验证ROS在PHSML介导ALI中的作用及其与TLR2、TLR4的关系,本文以小鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)作为研究对象,观察了ROS特异性抑制剂NAC、TLR2和TLR4封闭性抗体对PHSML损伤PMVECs以及促进PMVECs产生ROS的作用。结果显示,PHSML引起了PMVECs损伤、ROS产生增多,NAC、TLR2和TLR4封闭性抗体均减轻了PHSML导致的PMVECs结构损伤,抑制了PHSML增加PMVECs产生ROS的作用。此外,针对HMGB1在PHSML介导ALI中的作用,本文进一步观察了正常小鼠腹腔注射HMGB1抑制剂甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)处理后,静脉输入PHSML后肺组织形态与ROS含量的变化。结果显示,GL预先处理显著降低了静脉输入PHSML损伤正常小鼠肺组织、增加ROS产生的作用。说明HMGB1参与了PHSML介导ALI的ROS机制。上述研究表明,PHSML引起肺组织ROS的过度产生是失血性休克ALI的重要机制之一;PHSML介导肺组织ROS过度产生与释放的机制与TLR2、TLR4、HMGB1有关。以PHSML、ROS为干预靶点,对于防治重症休克导致的ALI具有积极的作用。