论文部分内容阅读
在拟南芥中,EIN3/EILs转录因子是一类典型的转录因子,通过结合到乙烯信号传导途径的下游基因的启动子上,调控下游基因的转录,完成乙烯信号响应。同时,它也可以在转录水平调控其他途径基因的启动子,从而调控植物生长和发育。本研究中,以苹果‘嘎拉’(Malus×domestic‘Royal Gala’)为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因(基因序列号:MDP0000423881)。序列分析表明,该基因包含1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白,与白梨(XP009341360.1)、枇杷(ACM89299.1)、碧桃(ABK35086.1)、梅(XP008231880.1)、川桑(XP010106128.1)、葡萄(XP002276380.1)的同源性较高。接着,我们利用生物信息学分析发现在苹果中,共包括12个MdEILs,根据它们处于染色体上的位置和基因特点,分别命名为MdEIL1、MdEIL02、MdEIL03、MdEIL04、MdEIL05、MdEIL06、MdEIL07、MdEIL08、MdEIL09、MdEIL10、Md EIL11、MdEIL12。基因结构分析发现基因家族成员之间外显子的数量不同,MdEIL1、MdEIL02、MdEIL03、MdEIL06、MdEIL09、MdEIL11、MdEIL12只含有1个外显子,MdEIL104、MdEIL05、MdEIL07、MdEIL08、MdEIL10含有2个外显子。MdEILs的同源性分析表明,EILs广泛存在高等植物中,单子叶植物、双子叶植物、苔藓植物和蕨类植物中都有EILs基因的存在,但是绿藻中不存在该类基因。qRT-PCR分析发现,MdEILs在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,在叶片中的表达量一般高于其他组织。说明MdEILs的表达模式呈组成性表达,且具有一定的组织差异性。qRT-PCR分析还发现,在叶片不同的发育时期,MdEILs的表达量呈规律性变化。暗示MdEILs可能参与叶片的衰老过程。MdEIL1过表达的转基因愈伤中,衰老相关基因(SAGs)的表达量升高。拟南芥中异位表达MdEIL1,叶片表现为早衰的表型。进一步研究发现,MdEIL1能够直接结合到miR164、ORE1、NYC1、NYE1和PAO基因启动子,促进拟南芥叶片提早衰老。EIN3/EILs的作为植物中一类转录因子,不仅可以绑定到不同的下游基因启动子上调控基因的表达,而且可以通过与不同植物蛋白互作,调控自身或其他蛋白的功能,进而调控植物的生长发育和逆境响应。实验室以MdBT2为诱饵进行酵母双杂筛库发现MdEIL1是MdBT2的一个互作蛋白。我们进一步通过酵母双杂交、pull-down和Co-IP的实验证明了MdEIL1和MdBT1、MdBT2的蛋白互作,并且MdBT1/2的TAZ结构域和MdEIL1的C末端区域是两者互作所必需的。利用体外降解实验,验证了MdBT2负调控MdEIL1蛋白积累水平,加入26S蛋白酶体抑制剂MG132后,MdBT2负调控MdEIL1蛋白积累的能力减弱。利用瞬时表达系统,验证了Md EIL1蛋白能够发生泛素化,并且这个过程是受MdBT2所调控的。另外,病毒载体处理35S::MdEIL1-HA愈伤,愈伤中衰老相关基因的表达量下降,暗示MdBT2可以通过MdEIL1抑制叶片衰老。