牛乳含有丰富优质全价的营养成分,是易消化吸收的天然食物。其中蛋白质含量为30～35g/L,大约80%为酪蛋白(26g/L),其余的20%为乳清蛋白(6g/L)。酪蛋白是在20℃的条件下将脱脂乳用酸调节pH4.6时沉淀的蛋白质。酪蛋白的主要成分是αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白。它们在结构和性质上存在着显著的差异且具有广泛的用途,如用于开发婴儿配方乳,生产酪蛋白源生物活性肽,生产出功能特性更强的蛋白质,优化奶酪和奶酪风味物质的生产过程等。由于酪蛋白分级分离产物的功能众多,其分离纯化制备工作也是关注的焦点,本文的目的就是以干酪素为原料,研究酪蛋白分级分离的方法,以期将酪蛋白主要成份αs-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白分离制取,使酪蛋白的使用领域增大,实用性增强和产品附加值提高并有利于各种乳及乳制品的深加工和资源利用。实验主要由四个部分组成。第一部分,以SinoChrom 300A C8柱为分离柱,建立了高效液相色谱法测定酪蛋白组分的方法。结果表明,干酪素样品用含2%巯基乙醇和1%的柠檬酸钠的7M的尿素溶液处理后,以水(内含体积分数为0.1%TFA)和乙腈(内含体积分数为0.1%TFA)分别为流动A相和B相,在梯度洗脱流速1. 0mL/min,检测波长214nm条件下,酪蛋白组分能被有效分离且具有较大的响应值,线性关系良好,峰面积和保留时间具有良好的稳定性,加样回收率较好,建立的方法切实可行。第二部分,以Q-Sepharose Fast Flow为离子交换介质,以干酪素为原料,对其直接用于酪蛋白组分的分离进行了研究。首先确定了其吸附pH,吸附容量,接着讨论了流速,洗脱程序对分离的影响,最终结果为流动相:A相为含4M尿素、0.5%ME,pH8.0的20mM的Tris-HCl缓冲液,Β相为含2M氯化钠的A相溶液,pH仍为8,洗脱流速1ml/min,检测波长280nm。以分步洗脱为洗脱方式,该洗脱程序能够实现各酪蛋白的初步富集,并为进一步的分离打下基础。第三部分,研究了尿素沉淀法分离酪蛋白的条件,分析了尿素浓度、酪蛋白浓度、沉淀温度对分离的影响。先进行单因素试验,再在各单因素最佳水平值的基础上,通过L9(34)正交实验结果确定了温度、酪蛋白浓度、尿素浓度这几个因素的最佳水平值组合得沉淀温度40℃,酪蛋白浓度6%,尿素浓度3.2mol/L。然后将尿素沉淀法与离子交换层析法接合对干酪素进行分级分离,最终得κ-酪蛋白的相对纯度57.3%,回收率49.8%;αs-酪蛋白相对纯度75.4%,回收率73.8%;β-酪蛋白相对纯度87.9%,回收率62.0%。第四部分,以离子交换层析后的αs-酪蛋白部分的收集液为例,利用交联葡聚糖Sephadex G-25进行了凝胶过滤脱盐操作,以含40mM碳酸氢氨的pH为8的溶液为流动相,从上样体积和洗脱流速进行讨论,得最佳上样量为3ml,最佳洗脱流速4ml。该层析过程能有效的去处离子交换层析中引入的盐分,且快速方便,非常有利于提高分离效率和节约分离时间。