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皮肤衰老包括内源性衰老和外源性衰老,其中80%的外源性衰老由紫外线照射引起,紫外线辐照引起的皮肤早衰称为皮肤光老化。近年来,人们对皮肤光老化的危害了解逐渐深入,因而抗皮肤光老化的意识不断加强,对抗皮肤光老化活性的天然产物的开发利用成为热点研究领域。近年来,很多研究表明,牡蛎有抗氧化、防衰老、降血糖、降压、抗癌等生物活性作用,牡蛎酶解产物具有较好的抗皮肤光老化作用,但是具体的功能活性成分的化学结构和作用机制尚不清晰。本文以香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)为研究对象,通过超滤分级、Sephadex-G25葡聚糖凝胶柱层析和反向液相色谱对牡蛎酶解产物进行分离纯化;结合细胞光老化模型筛选出活性最优组分,对其进行了化学结构表征并依据活性最优组分的肽序列进行了人工合成;通过建立小鼠皮肤光老化模型,探讨人工合成抗光老化活性肽对光老化皮肤的保护作用,阐明牡蛎抗光老化活性肽的作用机制。主要研究结果如下:(1)采用Sephadex-G25葡聚糖凝胶柱层析初步分离牡蛎酶解产物中的3~5kDa超滤组分,得到OP1~OP7共7个组分。依据各组分的体外抗氧化能力以及细胞光老化模型试验研究结果,筛选出活性最优组分。研究结果表明,OP1~OP7中OP5的蛋白含量最高(96.71%)。OP2和OP3对DPPH自由基的清除率最高(分别为89.49%和87.99%);OP2和OP3清除羟基自由基的能力也较高(分别为74.31%和68.14%);OP4和OP7则表现出较高的ABTS自由基清除能力(分别为26.10%和36.61%)。细胞实验结果表明,OP3、OP4、OP5对UV辐照的HaCaT细胞具有抗光老化活性。主要通过抑制UV辐照诱导细胞进入衰老状态,促进细胞增殖;同时增强SOD酶活,抑制ROS过表达,促进细胞恢复自身抗氧化能力。另外,UV辐照抑制HaCaT细胞PINP的表达,OP3、OP4、OP5能够促进PINP的表达,接近正常细胞,其中OP5的作用效果最佳。(2)采用反向液相色谱对细胞模型筛选出的抗光老化活性最优组分OP5进行分离纯化,沿用HaCaT细胞模型来评价液相纯化得到的多肽组分,结合ESIMS/MS技术和Uniprot数据库鉴定多肽的氨基酸序列,得到以下研究成果:组分OP5-3在液相色谱图中占比最大,远远超过其他峰,制备的样品量满足用于细胞活性评价实验和序列鉴定等研究,具备筛选抗光老化活性肽的潜力;细胞实验结果表明,OP5-3能够提高UV辐照的HaCaT细胞的增殖率,缓解UV辐照的细胞毒性。同时,OP5-3也能抑制MMP-1的异常表达,被证实具有抗光老化的潜力;结合ESI-MS/MS技术得到的质谱图和Uniprot数据从OP5-3中确定17条多肽序列,其中六条被选定进行活性验证等下一步研究,其氨基酸序列缩写分别为AIVAEVNEAAK、IGGIGTVPVGR、TALAIDAIINQK、VLVPTQEAVQK、GVAMNPVDHPHGGGEGR和LICIVPK。(3)采用固相合成的方法对质谱鉴定筛选出的六条多肽进行人工合成,使用RP-HPLC与ESI/MS结合的检测方法对合成的多肽进行纯度鉴定。由于人工合成过程中涉及化学试剂的添加,我们需要对合成的多肽进行活性验证,采取的依旧是HaCaT细胞光老化模型。另外尝试通过分子对接技术初步解释多肽发挥抗光老化作用的机制,具体的研究结论如下:固相合成法合成的六条多肽的纯度均达到95%,纯度达到细胞实验要求;六条多肽均能够提高UV辐照的HaCaT细胞的增殖率,缓解UV辐照的细胞毒性。同时,也能抑制MMP-1的异常表达,其中AIVAEVNEAAK抑制效果最显著,被证实具有抗光老化的潜力;分子对接模拟出AIVAEVNEAAK与MMP-1的相互作用模式,证明AIVAEVNEAAK(缩写PAK)通过多个氢键与MMP-1的活性中心位点紧密结合,有可能竞争性结合MMP-1的活性位点,降低MMP-1的酶活。(4)通过动物光老化模型评价PAK的抗光老化活性,皮肤宏观评价结果表明,各剂量的PAK对UV辐射诱导的皮肤光老化均表现出不同程度的保护作用,其中高剂量PAK作用效果最佳;小鼠皮肤皮下血管分析结果表明,造模8周的PAK中剂量组和造模10周的PAK高剂量组血管状态最接近NC组;皮肤含水量测定结果表明,各剂量的PAK均能提高皮肤的含水量,高剂量的PAK的效果最显著;皮肤组织病理变化分析结果表明,PAK可改善皮肤表皮过度角质化和炎症细胞浸润、缓解表皮增厚和纤维束排列紊乱等光老化皮肤病理性变化。另外PAK促进CD31的表达,与模型组相比,血管扩张、通透性增加和萎缩现象得到缓解。另一方面,炎症因子测定结果表明,PAK通过抑制促炎因子表达、促进抗炎因子表达发挥抗炎作用。抗氧化酶活力测定结果表明,PAK能够显著升高SOD和GSH-Px的酶活,提升皮肤组织的抗氧化能力,从而实现其抗皮肤光老化效果。