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2003年Grace Park 等人在利用14-3-3蛋白及Akt抗体筛选Akt作用底物时发现了一种新的由胰岛素诱导出来的 14-3-3 结合蛋白PRAS40(Proline-rich-Akt Substate,40kDa).DNA序列分析及纯化的蛋白体外实验表明,PRAS40是Akt直接作用的底物,且在人体内的各个组织均有表达,尤其以心脏和肝脏内表达量最高,该蛋白的序列分析表明他除了含有AKT磷酸化位点(Thr-246)外不含有任何其他的可别辩识作用位点.然而他却含有高达15%的脯氨酸(普通的蛋白脯氨酸的含量仪为5%),这些脯氨酸结构域是SH3 and/or WW 潜在的结合位点<,[2]>PRAS40 是一种新的发现于PI-3激酶信号通路中的蛋白.虽然它的基本功能尚不清楚,但因为它是Akt的作用底物且为14-3-3的结合蛋白,因此可以预见PRAS40在细胞的生命活动过程中一定起着十分重要的功能。
14-3-3蛋白于1967年首次在牛脑细胞中发现,它是一种酸性的、可溶性异源二聚体蛋白,根据它们在淀粉凝胶中的迁移率命名为14-3-3,其大小约为23-28kD。研究表明它是一个有关连接蛋白和脚手架蛋白的蛋白家族,可以和60多种蛋白相互作用并在所有真核细胞表达,目前已鉴定出在真核细胞中表达的七个亚型。参于真核细胞中的蛋白激酶介导的信号通路,在基因转录、细胞周期调控、前体蛋白运输中也起十分重要的作用。最近的研究发现它在治愈人类疾病,尤其是癌症上也有着广阔的前景。
利用 pDEST17-14-3-3/BL21 及 Pdestl5-PRAS40/BL21 重组菌株,通过亲和层析分离纯化出了HIS融合的14-3-3七种亚型及GST融合的PRAS40蛋白。
为了初步鉴定PRAS40与14-3-3的相互作用规律,我们通过gateway技术,构建了用于酵母双杂交系统的质粒pJG-PRAS40和pEG-PRAS40,同时通过酶切鉴定,证实成功构建了pEG-PRAS40和pJG-PRAS40质粒。将PRAS40和14-3-3各亚型质粒分别作为诱饵蛋白质粒及转录激活质粒共转化酵母细胞,通过β-半乳糖苷酶活性检测以及氨基酸营养缺陷生长实验分析它们之间的相互作用。酵母双杂交实验结果显示PRAS40可以和14-3-3亚型tau,beta,zeta及epsiIon相结合,epsiIon较强,beta和zeta次之,tau较弱。
通过本实验,初步鉴定了PRS40与14-3-3的相互作用规律,同时14-3-3和PRAS40蛋白的成功分离纯化为进一步的弄清其相互作用规律、生物学功能及药靶的找寻奠定了基础。