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乙偶姻(Acetoin,AC)是一种重要的生物基化学品,广泛用于食品、化工、医药等领域,可用来制备调香剂、增塑剂、稳定剂、起泡剂、液晶材料和药物手性载体等。本论文以粘质沙雷氏菌H32(Serratia marcescens H32)为出发菌株,通过发酵调控结合基因工程手段对生物法制备乙偶姻开展了相应的研究工作,并对双水相萃取发酵液中乙偶姻进行了初步研究。具体研究内容如下: 1.乙偶姻发酵条件与发酵培养基优化 通过摇瓶实验,初步确定粘质沙雷氏菌H32发酵生产乙偶姻的最佳培养条件和培养基成分。最佳培养条件为:装液量20ml,培养温度28℃,初始pH7.0,接种量5％。在此基础上通过单因素实验、Plackett-Burman设计实验、最速上升实验和响应面实验对粘质沙雷氏菌H32发酵生产乙偶姻的培养基组分进行了优化,获得了发酵培养基的最优组成:蔗糖163g/l,柠檬酸铵12g/l,玉米浆干粉9.8 g/l,KH22PO40.9g/l,MgSO40.2g/l,MnSO40.15g/l,FeSO40.02g/l。经过培养条件与培养基成分优化,乙偶姻发酵水平由15.5 g/l提高至41.5 g/l。 2.发酵罐中粘质沙雷氏菌H32乙偶姻发酵特性研究 首先在3.7L发酵罐中研究了不同搅拌转速下粘质沙雷氏菌H32发酵生产乙偶姻的特性,发现搅拌转速调控为600 r/min最有利于乙偶姻的生产。搅拌转速过低时副产物2,3-丁二醇积累过多,导致乙偶姻产量降低。搅拌转速过高时虽然有利于菌体的生长,但糖耗速率却有所下降,也不利于乙偶姻的合成。在此实验基础上建立了两阶段转速调控发酵策略,控制初始搅拌转速为700 r/min,发酵进行8 h后调整为600 r/min。利用此调控策略时,发酵进行26 h可以得到44.9g/l乙偶姻,生产效率为1.73g(1.h),比单一转速调控发酵的最高生产效率提高了7.5％。其次对乙偶姻的补料分批发酵进行了研究,确定了维持蔗糖浓度为10 g/l的恒底物浓度补料策略,在此补料策略下乙偶姻的最终浓度可以达到60.5 g/l,产率为1.44 g/(1·h),得率为0.28g/g蔗糖。最后在30L发酵罐中进行了乙偶姻发酵放大实验,在此规模下乙偶姻产量可以达到59.1 g/l。同时针对粘质沙雷氏菌H32发酵过程中产生大量泡沫的问题,设计了一种螺旋管喷溅消泡装置,采用这种装置可以对发酵过程中产生的泡沫行进破碎并回收,保证了发酵过程的正常进行。 3.粘质沙雷氏菌H32过表达乙偶姻操纵子研究 在本实验室已克隆到乙偶姻操纵子的基础上,进行了乙偶姻操纵子在粘质沙雷氏菌H32中的过表达研究。构建了能够在粘质沙雷氏菌H32中过表达乙偶姻操纵子的载体pPbud-SD,并将此载体电转入粘质沙雷氏菌H32中,得到粘质沙雷氏菌H32-SD。发酵实验表明,在28℃温度下进行发酵实验时,由于过表达操作造成菌体代谢负担,导致粘质沙雷氏菌H32-SD糖耗速率较慢,乙偶姻产量仅为38.5 g/l。升高发酵温度至30℃后,粘质沙雷氏菌H32-SD糖耗速率加快,发酵结束时乙偶姻产量为49.7 g/l,较对照菌的分批发酵产量提高了29％。进一步进行补料分批发酵后,乙偶姻的产量达到55.2g/l,低于野生菌的补料分批发酵结果。说明乙偶姻操纵子过表达有利于分批发酵中乙偶姻的生产,但其补料分批发酵效果不佳。 4.粘质沙雷氏菌H32过表达NADH氧化酶研究 针对粘质沙雷氏菌H32发酵生产乙偶姻过程中副产物2,3-丁二醇积累过多的现象,进行了NADH氧化酶在粘质沙雷氏菌H32中的过表达研究。首先构建了能够在粘质沙雷氏菌H32中过表达短乳杆菌(Lactobacillus brevis)NADH氧化酶的载体pPbud-NOX,并将此载体电转入粘质沙雷氏菌H32中,得到粘质沙雷氏菌H32-NOX。发酵实验表明,NADH氧化酶的过表达能够在发酵过程中有效地减少副产物2,3-丁二醇的积累,有利于乙偶姻产量的提高。在分批发酵实验中粘质沙雷氏菌H32-NOX2,3-丁二醇的产量仅为12.8g/l,比对照菌降低了52％。乙偶姻产量为59.6 g/l,较对照菌提高了33％。在补料分批发酵实验中,乙偶姻产量进一步得到提高,经过40小时发酵乙偶姻产量可以达到75.2g/l,产率为1.88g/(l·h),得率为0.36 g/g蔗糖。 5.双水相萃取发酵液乙偶姻研究 在利用粘质沙雷氏菌H32发酵生产乙偶姻的研究基础上,进行了发酵结束后发酵液中乙偶姻的双水相萃取实验。经过筛选选择丙酮/磷酸氢二钾双水相体系进行研究,首先考察了不同浓度丙酮和磷酸氢二钾对发酵滤液中乙偶姻萃取效果的影响,选取了浓度分别为30％(w/w)和35％(w/w)的丙酮和磷酸氢二钾来组成双水相萃取体系。用此体系萃取发酵滤液,乙偶姻的分配系数为22.3,回收率达到96.4％。在此基础上进行了利用双水相体系萃取发酵液中乙偶姻的研究。实验结果表明利用双水相体系萃取发酵液也能得到较好的效果,在上述条件下乙偶姻的回收率可以达到94.3％,2,3-丁二醇的回收率也可以达到93.5％。同时发酵液中的主要杂质菌体、蛋白、蔗糖与灵菌红素都可以得到较好地去除,去除率在85％以上。最后研究了下相中磷酸盐的回收,经过pH调节和溶析结晶操作,磷酸盐的回收率可以达到93.7％。