论文部分内容阅读
【目的】研究鼠巨细胞病毒(MCMV)对神经干细胞Wnt信号通路上游分化相关靶基因Wnt-3和Wnt-7a蛋白表达的影响,以进一步探讨CMV致胎脑发育异常的分子机制。【方法】⑴分离培养小鼠神经干细胞(NSCs):剖宫取出孕13.5d的BALB/c胎鼠,去除脑膜,取脑组织,用PBS冲洗,过滤制备单细胞悬液,用含EGF (20ng/mL)、bFGF(20ng/mL)和B27(2%)的DMEM/F12培养基培养。第3代小鼠神经干细胞用于后续实验;⑵建立MCMV感染NSCs分化培养细胞模型:用高、中、低三种感染复数(MOI分别为5、1和0.1)的MCMV毒株感染NSCs,用含2%胎牛血清(无EGF、bFGF和B27)的DMEM/F12培养基培养诱导其分化。同期设正常NSCs分化培养作为对照;⑶MCMV感染对神经干细胞Wnt信号通路上游分化相关靶基因蛋白Wnt-3和Wnt-7a表达的影响:用Western blot法检测分化培养后0.5d、1d、2d、3d、4d和5d NSCs Wnt信号通路上游蛋白Wnt-3、Wnt-7a表达水平的动态变化。实验重复三次。【结果】⑴小鼠神经干细胞体外分离和培养成功,可连续传代,保持球形生长的能力;采用含2%胎牛血清(无EGF、bFGF和B27)的DMEM/F12培养基培养可进一步诱导其分化;⑵当MCMV感染NSCs后,镜下可见细胞贴壁受影响,已贴壁的神经球出现肿胀飘起,神经球边缘的细胞发生脱落,部分细胞崩解坏死。细胞形态改变随病毒感染复数(MOI)的增加而更加明显;⑶Western blot法检测结果: a)正常对照组Wnt-3蛋白表达呈双峰型,在分化2d和5d时达峰值,第二峰值高于第一峰值。各感染亚组Wnt-3蛋白表达亦于分化2d达峰值;MOI=0.1亚组在分化5d出现第二峰,但峰值显著低于第一峰,而MOI=1和5亚组在分化2d后表达水平逐渐下降,第二峰缺失;除MOI=0.1亚组分化2d以外,其余各感染亚组与各时间点Wnt-3蛋白表达量均显著低于正常对照组(P<0.05);MOI=1亚组分化培养0.5d和2d与MOI=5亚组分化培养1d、2d和5d表达量均明显低于MOI=0.1亚组(P<0.05); b)正常NSCs分化培养后Wnt-7a蛋白表达先增后降,在分化1d达峰值。MOI=0.1亚组Wnt-7a蛋白表达的时序性变化与正常对照组相似。而MOI=1和5亚组Wnt-7a蛋白表达量在分化0.5d和1d明显低于正常对照组和MOI=0.1亚组(P<0.05),峰值后移至分化培养3d,MOI=1亚组峰值显著低于正常对照组(P<0.05)。【结论】⑴MCMV抑制分化培养NSCs细胞的Wnt-3蛋白表达,其抑制程度随感染滴度增加和分化进程而趋于明显;MCMV在分化早期(0.5d～1d)抑制Wnt-7a蛋白表达,使其峰值后移,其抑制效应随感染滴度增加更趋明显;⑵MCMV抑制NSCs Wnt信号通路上游分化相关靶基因Wnt-3和Wnt-7a蛋白表达可能是其干扰NSCs增殖分化导致胎脑损伤的重要机制之一。