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第一章清开灵注射液对小鼠免疫功能影响的体外研究目的:体外研究清开灵注射液(Solution of qingkailing,QKL)对小鼠T细胞活化、增殖、细胞周期,对腹腔巨噬细胞(Mφ)吞噬功能和一氧化氮(NO)的产生及对胸腺细胞凋亡的影响,探讨其对小鼠免疫功能的作用及机制。方法:利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测T细胞早期活化抗原CD69的表达情况,分析QKL对未加刺激剂和刀豆蛋白A(Con A)刺激的T细胞早期活化的影响;用MTT、WST-1和羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色结合流式细胞术检测QKL对未加刺激剂和Con A刺激的T细胞增殖的影响;碘化丙锭(PI)染色结合流式细胞术分析QKL对未加刺激剂和Con A刺激的T细胞周期分布的影响;CFDA-SE标记的大肠杆菌(E. Coli)结合流式细胞术检测QKL对小鼠腹腔Mφ吞噬功能的影响;Griess反应试剂盒检测QKL对脂多糖(LPS)激活的Mφ产生NO的影响;PI染色结合流式细胞术检测QKL对小鼠胸腺细胞自发凋亡和地塞米松(DEX)诱导的细胞凋亡的影响。结果:QKL对未加刺激剂的T细胞的早期活化、增殖和细胞周期都没有明显影响,但对ConA刺激的T细胞行为有明显影响。ConA刺激12h后,T细胞表面CD69表达百分率为(63.12±3.07)%,终浓度为1/5120的QKL,有降低CD69表达的趋势,但与ConA相比,没有显著差异;加入1/1280的QKL后,CD69表达率降低至(56.24±2.43)%,与ConA对照相比,有显著差异;1/320和1/80的QKL,CD69表达率分别降低为(51.89±2.77)%和(39.09±1.39)%,与ConA对照相比,有极显著差异。QKL可抑制ConA刺激的细胞增殖,浓度为1/5120时,MTT和WST-1法测得的OD值及CFDA-SE法测得的增殖指数(Proliferation index,PI)与ConA刺激对照组相比,有显著差异,浓度高于1/2560时,与ConA对照相比,有极显著差异,三种方法检测QKL抑制ConA刺激的细胞增殖作用的EC50分别为:1/405.34、1/551.14和1/435.73;QKL对ConA刺激的细胞周期分布影响没有周期特异性,表现为:QKL增加ConA刺激的细胞中处于S期和G2/M期的细胞数目,降低处于G0/G1期的细胞数目,增加Sub-G1期细胞数目,但最高浓度时(1/160原液)G2/M期细胞降低,Sub-G1细胞明显增加;QKL可抑制Mφ的吞噬功能,表现为:未加药组Mφ吞噬CFDA-SE标记的E.Coli 2 h后,荧光强度明显增强,吞噬率为(61.33±2.45)%。加入终浓度为1/2700、1/900、1/300和1/100的QKL后吞噬率分别降低至(57.62±1.67)%、(53.55±2.30)%、(48.92±2.01)%和(39.32±0.68)%;QKL可以降低LPS激活的Mφ产生NO的量;对小鼠胸腺细胞的自发凋亡和DEX诱导的细胞凋亡都有显著的拮抗作用,与对照相比,均为P<0.01。结论:OKL对小鼠免疫功能有多种调节作用:可有效抑制多克隆刺激剂诱导的小鼠T细胞的早期活化和增殖,对细胞周期分布也有明显影响,但没有周期特异性;可抑制腹腔Mφ的吞噬功能和激活后NO的产生,拮抗胸腺细胞的凋亡。结果提示QKL能有效抑制机体免疫功能,不仅对特异性细胞免疫功能有抑制作用,对非特异性免疫功能也有的抑制作用,这种免疫抑制作用可能是OKL临床治疗免疫相关疾病有效的基础。第二章清开灵注射液对正常、DTH和脓毒症小鼠的影响目的:第一章的体外实验初步证明了QKL的负向免疫调节作用,在此基础上,对处于三种不同免疫状态的小鼠,即正常小鼠、迟发型超敏反应(DTH)小鼠和脓毒症小鼠分别皮下注射QKL,观察其体内的免疫调节作用,并推测作用机制。方法:连续皮下注射QKL 5 d,通过检测小鼠体重、免疫器官指数和淋巴细胞对ConA刺激的反应,分析QKL对正常小鼠免疫功能的影响;采用二硝基氟苯(DNFB)诱发小鼠耳朵肿胀,发生接触性皮炎,建立DTH模型,通过比较QKL与NS对照对小鼠脾脏指数和发病耳肿胀抑制率评价QKL体内对小鼠的免疫调节功能;采用盲肠结扎穿孔术(CLP)后引起的多细菌性腹膜炎,建立小鼠脓毒症模型,通过观察QKL对小鼠存活状况的影响,评价QKL的免疫调节作用。结果:QKL有降低正常小鼠体重趋势,但与NS对照相比,未见明显差异;QKL可明显降低正常小鼠胸腺指数,但对脾脏指数没有影响;QKL用药组小鼠淋巴细胞体外对ConA刺激的反应能力明显降低。对DTH小鼠的影响为:与NS对照相比,QKL能明显减轻发病耳朵的肿胀率,降低脾脏指数。对脓毒症小鼠,QKL治疗组与NS对照相比,小鼠死亡率增加。结论:QKE降低正常小鼠胸腺指数和淋巴细胞对刺激剂的反应能力,减轻DTH反应,增加脓毒症小鼠的死亡率,表明QKL对机体免疫应答有抑制作用,其机制可能与QKL抑制T细胞和巨噬细胞功能有关。第三章清开灵注射液及其含药血清体外抑制HIV-1作用目的:探讨QKL及其药物血清体外抑制HIV-1的作用。方法:用MTT比色法检测QKL对H9/HIV-1ⅢB细胞(慢性感染HIV-1ⅢB的H9细胞)和MT-2细胞的毒性;采用荧光染料Calcein-AM标记的H9/HIV-1ⅢB细胞和系列稀释的QKL和药物血清作用后,与MT-2细胞混合培养,2 h后在荧光下计数融合细胞数目,评价QKL及其药物血清对早期细胞融合的影响;用MTT法检测QKL对HIV-1ⅢB感染细胞的保护作用;用HIVp24抗原试剂盒检测HIV-1感染MT-2细胞的培养上清p24抗原的含量,分析QKL对HIV-1复制的影响。结果:QKL对H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞的CC50分别为1/50.76和1/36.97;抑制H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞早期融合的EC50=1/235.29,SI=6.36;抑制HIV-1ⅢB细胞诱导MT-2细胞形成合胞体的EC50=1/198.02,SI=5.36;H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞混合培养和HIV-1ⅢB感染MT-2细胞时,QKL保护病毒感染细胞免于死亡的EC50分别为1/166.67和1/144.93,SI分别为4.51和3.92;抑制p24抗原产生的EC50=1/175.44,SI=4.75;QKL药物血清也可抑制H9/HIV-1ⅢB细胞和MT-2细胞的早期融合,保护细胞免于死亡。结论:QKL及其药物血清体外有一定的抗HIV-1活性,作用机制可能是多靶点的,不仅可抑制病毒进入,还可抑制病毒的复制。