背景：急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)是一种在形态学、遗传学及表观遗传学上具有异质性的疾病,主要特点是原始及幼稚髓系白血病细胞在骨髓及外周血不断的蓄积,是成人急性白血病(acute leukemia, AL)中最常见的一种类型。美国肿瘤协会2014年发布的数据显示在美国每年有大约1.88万初发AML病例出现,而死亡人数高达1万以上,排在肿瘤相关死亡疾病的第六位,目前AML的治疗对血液科及肿瘤科医生来说仍然是的一个比较大的挑战。虽然,不断有新的化疗药物出现,化疗方案也不断优化及改进,疾病的缓解率也在不断提高,但是病人的预后还是不容乐观,良好核型患者的10年总体生存率(overall survival,OS)为550%～80%,中危核型及高危核型的患者的10年OS分别为30%～40%和8%-20%,难治和复发仍然是影响AML患者预后的最重要的因素。目前研究表明,白血病细胞是来源于白血病干细胞(leukemia stem cells, LSC),这群细胞只占白血病细胞中很少的比例,但这一小群细胞具有自我更新、不断的生长及向成熟白血病细胞分化的能力,能够维持着白血病的原始/幼稚特性,并且LSC大部分处于细胞周期中的G0/1期(静止期),生存信号通路表达异常,这使得它们对那些针对细胞快速增殖的传统化疗药物不敏感,这也就是AML难治复发的根源。过去十几年,在明确及理解LSC的生物学特性的研究方面已经取得了有了长足的进步,但是特异性的靶向杀伤LSC而不影响正常的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)依然是一个艰巨的任务。因此,开发一类只针对LSC而不影响正常HSC的靶向药物是我们未来实现清除LSC治愈AML这一终极目标之前的挑战及方向,也是AML最根本、最有效的治疗策略。双硫仑(Disulfiram, DS)是二硫代氨基甲酸酯(DDTC)家族的成员之一,在临床上作为常用的抗酗酒药物已经有60多年的历史了,具有螯合金属离子的能力,例如铜、锌等金属离子,并且能够与巯基基团和谷胱甘肽反应。DS抗酗酒的原理主要是其不可逆的抑制乙醛脱氢酶(ALDH)的活性,造成乙醛代谢障碍而在体内蓄积,从而造成酗酒者恶心、呕吐、头痛等不适症状。从上世纪70年代开始多个实验显示DS和它的代谢物能够增强某些肿瘤的化疗效果(Lewisonl977),而且不论在体外实验还是临床实验都证明它是一种可靠的抗肿瘤药。Lewison是最先报道DS具有抗乳腺癌的活性,并且成功的对64例高危的乳腺癌进行了Ⅱ期临床试验及应用于肝转移癌和Ⅳ期的转移性眼黑色素瘤患者。最近,正在进行两个DS的临床试验：DS作为辅助药物(Clinical-Trials.gov Identifier NCT00312819)和DS联合葡萄糖酸铜(ClinicalTrials.gov IdentifierNCT00742911)治疗晚期实体肿瘤。但是,DS的抗肿瘤机制仍然不明确,目前认为它抗肿瘤的机制主要为：1)DS联合Cu形成复合物,在体内体外实验中对多种肿瘤具有强烈的抑制蛋白酶体及诱导凋亡活性；2)DS能够阻断p-gp膜泵的突变,逆转肿瘤对化疗药物的耐药性；3)能够抑制NF-κB的持续激活；4)在体内能够减少血管生成及降低肿瘤生长,抑制基质金属蛋白酶(MMP)的活性及肿瘤细胞的浸润；5)DS能够增加线粒体膜的通透性,与Zn/Cu形成复合物,进而抑制Zn依赖性的MMP及Cu/Zn超氧岐化酶(SOD1)活性,减少超氧根离子歧化形成H202,改变细胞的氧化还原状态而促进细胞的凋亡。我们前期研究发现了DS/Cu能够通过JNK通路逆转急性髓系白血病细胞HL-60耐药细胞株对多柔比星的耐药,我们还发现DS及DS/Cu能抑制急性髓系白血病干细胞(LSC)、急性T淋巴细胞白血病Molt4细胞和淋巴瘤Raji细胞增殖及诱导其凋亡,其机制可能与抑伟NF-κB活性及及调节细胞氧化应激反应增加细胞内活性氧(ROS)有关。但DS/Cu是否具有杀伤LSC及相关机制及上游通路仍需要进一步明确。活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是在细胞氧化代谢过程中不可避免产生的自然产物,它主要包括有非自由基(如H2O2)和自由基(羟基和超氧化合物),由于ROS具有高度的活性属性,这样可能会造成细胞内DNA、蛋白质及脂质的过氧化破坏,而在正常生理状态下,细胞可以利用细胞内的抗氧化及防御系统抵御这些有毒产物对自身的伤害,从而保持细胞氧化还原稳态的稳定。然而,当细胞内ROS水平变化巨大时,打破了这种氧化还原状态的稳定,短时间急剧升高的ROS能够诱导细胞的凋亡。目前研究显示,诱导细胞内ROS蓄积无疑能够导致多种细胞凋亡,并且能够特异性靶向杀伤一些肿瘤细胞。研究表明,ROS可以影响涉及介导增殖或凋亡的信号通路,例如MAPKs、p53,、AP-1及NF-kB等信号通路。Trachootham等发现,当存在氧化应激的情况下,肿瘤细胞内的ROS水平变化幅度比非肿瘤细胞的明显要大,同时也发现了应用促氧化齐PEITC能够促进CLL肿瘤细胞内的ROS大幅增加到突破细胞存活的阈值水平,从而诱导肿瘤细胞的凋亡,而对正常的淋巴细胞没有影响。最近Lagadinou等人也发现,一群较低水平ROS的白血病细胞具有AML干细胞特性,而且这群细胞高表达BCL-2,予以ABT-263抑制BCL-2活性后可以减弱细胞线粒体途径的的氧化磷酸化,这群低水平ROS细胞体内的ROS明显蓄积,细胞凋亡也明显增加,对于正常的HSC却无明显影响,这可以说明调节细胞氧化应激可能是靶向杀伤白血病干细胞的一个良好位点,而ROS无疑是调节这一过程的理想的靶点。肿瘤坏死因子(tumor necrosises factor-alpha, TNF-α)是一个具有强劲促炎作用的细胞因子,对多种细胞功能的调节具有多效性,对细胞的增殖、分化及凋亡等一系列的细胞生命活动过程具有重要的调节作用。已经清楚的知道了TNF-α在炎症及休克状态中的重要病理生理作用,而这个过程中内皮细胞是它首要的靶向细胞。有研究报道TNF-α能够增加细胞内ROS含量,也能上调细胞浆膜NADPH氧化酶及脂氧化酶的表达水平,而且TNF-α能够触发ROS产生伴随细胞毒作用及细胞死亡,在这些研究中,TNF-α诱导ROS的产生主要来源于线粒体。在急性白血病细胞中,TNF-α能够通过抑制NF-kB通路诱导细胞凋亡,这其中也涉及了ROS的产生及激活JNK通路。因此,TNF-a可能是抗肿瘤药物在诱导ROS蓄积杀伤肿瘤细胞过程中重要的细胞因子。近几十年在研究及治疗肿瘤的过程中,开发新药一直是科研的热点,然而开发一类新药成功几率较低,而且将会耗费大量的人力、经费,而且药物真正运用到临床可能需要多年的临床试验验证,这有将耗费大量时间。因此,在开发新药存在各种缺点时,大量的科研工作者将目光投入到“老药新用”的科研思路上,尤其运用廉价易得、安全无毒或低毒的老药治疗肿瘤是目前药物开发的一条可行性捷径。Ds可以抑制醛脱氢酶在临床上作为抗酗酒药物已经有60多年历史,毒副作用小且价格低廉易得,同时也是一类金属螯合剂,能够结合铜(Cu)并转运入细胞内。最近多个学者关注DS并应用于肿瘤的治疗,研究显示DS联合Cu (DS/Cu)对黑色素瘤、间质瘤、肺癌等实体肿瘤细胞及白血病细胞具有细胞毒作用以及对传统化疗药具有增敏作用,同时也发现DS对胶质瘤、乳腺癌等一些实体肿瘤干细胞具有细胞毒性作用。我们课题组前期工作已经发现DS能够增强AML耐药株对化疗药物的敏感性,我们还发现DS/Cu可以增加白血病细胞内ROS含量激活JUK及MAPK通路以及抑制NF-kB通路诱导急性髓系白血病(AML)干细胞细胞凋亡。为了进一步验证DS/Cu是否能够诱导AML干细胞凋亡及分子机制,本实验以分选的CD34+CD38-KG1α细胞作为AML干细胞,研究DS/Cu能否诱导AML干细胞凋亡及其分子机制,为DS/Cu在白血病治疗方面提供更多的科学依据。研究目的：本课题建立CD34+CD38-KG1α细胞的AML干细胞模型,明确Disulfiram(DS)单药及DS联合Cu离子(DS/Cu)在体外诱导AML干细胞凋亡,并从ROS蓄积的角度出发,进一步探讨引起ROS上调的上游分子机制。研究方法：1、应用磁珠分选术分选出人急性髓系白血病细胞株KGla细胞；2、Annexin-V标记,流式细胞术检测DS(5μM)及DS/Cu (5μM/0.5μM)对CD34+CD38-KG1α细胞的诱导凋亡作用,并比较与对照组Control之间的关系；3、利用DCFA-DA法,流式细胞术检测DS及DS/Cu作用24h后CD34+CD38-KG1α细胞中ROS水平的变化,比较各组之间ROS变化率(ROS变化率=测试组/空白对照组)的差别；4、利用Annexin-V标记,流式细胞术检测DS/Cu联合ROS清除剂NAC(10mM)后的对CD34+CD38-KG1α细胞的诱导凋亡能力,并比较其与DS/Cu诱导凋亡能力的差异；5、利用实时荧光定量PCR法检测空白对照、DS(5μM)、DS/Cu5μM/0.5μM)及DS/Cu+NAC5μM/0.5Mm/10Mm)处理CD34+CD38-KG1α细胞24h后TNF-α、 CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK等凋亡基因表达的变化,采用2-Act法对PCR结果进行计算,分析各种不同处理组上述基因的mRNA表达变化。6、利用Western Blot法检测空白对照、DS、DS/Cu及DS/Cu+NAC处理CD34+CD38-KG1α细胞24h后TNF-α蛋白水平,并比较各组之间TNF-α蛋白表达量的变化。7、利用DCFA-DA法,流式细胞术检测Control、DS/Cu、TNF-α mAb(2μg/mL)、TNF-α mAb(2μg/mL)+DS/Cu、IgG(2μg/mL)及IgG(2μg/mL)+DS/Cu作用24h后CD34+CD38-KG1α细胞中ROS水平的变化,比较各组之间ROS变化率的差别；8、利用Annexin-V标记,流式细胞术检测Control、DS/Cu、TNF-α mAb(2μg/mL)、TNF-α mAb(2μg/mL)联合DS/Cu、IgG(2μg/mL)及IgG(2μg/mL)联合DS/Cu作用24h后对CD34+CD38-KG1α细胞的诱导凋亡能力,并比较Control、TNF-α mAb、IgG组之间的凋亡差别及Control、DS/Cu、TNF-α mAb+DS/Cu、IgG+DS/Cu组之间的凋亡差别；9、采用SPSS13.0软件进行统计学分析,计量资料用M±S表示,两组间均数的比较使用两独立样本t检验方法；多组间均数比较使用单因素方差分析方法进行统计,在方差分析显著的情况下采用LSD方法(方差齐性分析)进行多重比较,方差不齐情况下采用近似F检验代替方差分析后采用Dunnett’s T3方法进行多重比较(检验水准为α=0.05,双侧检验,NS代表无统计学意义,*代表P<0.05,**代表P≤0.01,***代表P≤0.001)。研究结果：1、AML干细胞模型建立。采用抗人CD34-APC、CD38-PE双抗标记,流式细胞术检测具有干细胞特性的CD34+CD38-亚群细胞比例,分选前CD34+CD38-亚群细胞占KG1α细胞比例为(64.73±2.01)%,经MACS分选后CD34+CD38-KG1 α细胞比例为(95.37±1.84)%。2、DS及DS/Cu均能诱导AML干细胞的凋亡。设置空白对照、DS单药(5μmol/L)、DS/Cu (5 μmol/L/0.5 μmol/L)3组,各组药物处理CD34+CD38-KG1α 24h后,流式细胞术检测凋亡细胞比例,结果显示空白对照组、DS单药组及DS/Cu组凋亡细胞比例分别为(6.65±0.64)%、(11.87±1.30)%和(27.43±1.65)%,DS单药组和DS/Cu组诱导AML干细胞凋亡的比例明显高于空白对照组(P=0.008和P=0.001),此外,DS/Cu组诱导AML干细胞凋亡的比例也显著高于DS单药组(P<0.001)。根据统计分析结果显示,我们可以认为DS、DS/Cu均可以诱导细胞的凋亡,但联合Cu后可以明显增强DS诱导细胞凋亡能力。3、DS及DS/Cu均能使AML干细胞内ROS蓄积。设置空白对照、DS单药(5μmol/L)、DS/Cu (5μmol/L/0.5μmol/L) 3组,各组药物处理CD34+CD38-KG1α 24h后,流式细胞术检测ROS水平。结果显示空白对照组、DS单药组及DS/Cu组ROS水平分别为(359.67±32.50)、(497.38±36.85)、(1008.93±83.72),DS单药组及DS/Cu组ROS水平较空白对照组上升了(1.39±0.12)倍、(2.81±0.11)倍(P=0.028和P=0.001)；并且DS单药组与DS/Cu组ROS变化率也有显著性统计学差异(P<0.001)。以上统计分析表明,DS、DS/Cu组均能诱导AML干细胞ROS蓄积,但DS/Cu诱导能力显著高于DS单药组。4、NAC清除ROS蓄积可以抑制DS/Cu诱导的AML干细胞凋亡。设置DS/Cu (5μmol/L/0.5μmol/L)、DS/Cu+NAC (5μmol/L/0.5μmol/L/10m mol/L)2组,各组药物处理CD34+CD38-KG1α24h后,流式细胞术检测凋亡细胞比例及ROS水平。结果显示DS/Cu组及DS/Cu+NAC组ROS水平分别为(1008.93±83.72)、(413.95+70.90),统计学具有明显差异(P=0.001),细胞凋亡比例分别为(27.43±1.65)%、(12.37±0.85)%,统计学同样具有明显差异(P=0.001)。以上结果分析表明,加入ROS清除剂NAC后可以挽救DS/Cu引起的细胞凋亡,说明ROS是造成细胞凋亡的重要因素。5、TNF-α是DS/Cu诱导AML干细胞ROS蓄积的上游基因。设置空白对照、DS单药(5μmol/L)、DS/Cu (5μmol/L/0.5μmol/L)及DS/Cu+NAC (5μ mol/L/0.5 μ mol/L/10m mol/L) 4组,上述各组药物处理CD34+CD38-KG1α24h后,qRT-PCR验证与调节凋亡相关的基因TNF-α、CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK的mRNA水平,结果显示DS组及DS/Cu组相比于空白对照组能上调上述基因(P<0.05),且DS/Cu组较DS组上调更明显(P<0.05),予以NAC抑制ROS蓄积挽救细胞凋亡后,相比于DS/Cu组,在DS/Cu+NAC组中TNF-α依然高表达(P=0.726),而CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK基因水平明显下调(P<0.05)；Western blot检测细胞内TNF-α的表达,结果同样显示DS组及DS/Cu组均可明显上调TNF-α蛋白表达水平,其中联合组上调更明显；加入ROS抑制剂NAC后不能抑制DS/Cu引起的TNF-α表达水平的上调。以上结果表明,TNF-α是DS/Cu诱导AML干细胞ROS蓄积的上游分子,而CD40、TNFRSF11B、TNFRSF1B、HRK的表达受ROS的水平调控。6、中和TNF-α可以抑制DS/Cu诱导的AML干细胞ROS的蓄积。先予以中和抗体TNF-α mAb(2μg/ml)及对照抗体IgG(2μg/ml)预处理CD34+CD38-KG1α细胞2h,设置空白对照组、DS/Cu组、TNF-a mAb组、TNF-a mAb+DS/Cu组、IgG组、IgG+DS/Cu组(DS、Cu溶度同前),不同处理作用CD34+CD38-KG1α细胞24h,流式细胞术检测各组细胞ROS水平,结果显示6组细胞ROS水平依次为(355.33±35.23)、(985.33±120.97)、(280.00±23.07)、(451.33+44.66)(328.00±30.27)、(1145.33±59.50),DS/Cu、TNF-α mAb组、TNF-α mAb+DS/Cu组、IgG组、IgG+DS/Cu组的ROS变化率分别为2.78±0.25、0.82±0.14、1.28±0.18、0.93+0.16、3.25±0.49,结果显示TNF-α mAb+DS/Cu组相比DS/Cu的ROS变化比率由2.78±0.25倍下降到1.28±0.17倍,差异有统计学意义(P<0.001),而IgG+DS/Cu组相比DS/Cu组差异无统计学意义(P=0.23),并且TNF-α mAb及IgG组相比空白对照组的ROS水平也无显著性差异(P=0.09和P=0.50)。以上统计分析表明,中和抗体TNF-α mAb及对照抗体IgG对AML干细胞ROS的蓄积无明显影响,但是TNF-α mAb能够抑制DS/Cu诱导的ROS蓄积,而IgG对DS/Cu诱导ROS蓄积无影响。7、中和TNF-α可以挽救DS/Cu诱导的AML干细胞凋亡。先予以中和抗体TNF-α mAb及对照抗体IgG预处理CD34+CD38-KG1α细胞2h,设置空白对照组、DS/Cu组、TNF-α mAb组、TNF-α mAb+DS/Cu组、IgG组、IgG+DS/Cu组(溶度同前),不同处理作用CD34+CD38-KG1α细胞24h,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,结果显示6组细胞凋亡率分别为(5.74+0.91)%、(27.0±2.33)%、(6.08±1.01)%、(12.17±0.91)%、(7.57+0.84)%、(24.17±2.03)%,TNF-α mAb、IgG组与Control的细胞凋亡率无显著性的统计学差异(P=0.69,P=0.063),TNF-α mAb+DS/Cu组较DS/Cu的细胞凋亡率明显下调,差异具有统计学意义(P=0.004),而IgG+DS/Cu与DS/Cu组比较无显著性差异(P=0.188)。以上结果统计分析表明,抗体本身对细胞的凋亡无明显影响,而抗体中和TNF-α后可以挽救DS/Cu诱导的ROS蓄积而导致的AML干细胞凋亡。结论：1、DS和DS/Cu均可诱导AML干细胞凋亡,而且DS/Cu诱导AML干细胞凋亡的能力较DS单药显著。2、DS/Cu可显著提高AML干细胞内ROS的水平,加入ROS清除剂NAC后可以显著挽救DS/Cu诱导的AML干细胞的凋亡,说明细胞内ROS的蓄积是DS/Cu诱导AML干细胞凋亡的重要因素。3、中和TNF-α后可以抑制ROS的蓄积,挽救DS/Cu诱导的细胞凋亡,提示DS/Cu是通过上调TOF-α表达诱导ROS蓄积导致AML干细胞凋亡。