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第一部分淋巴特异性探针(Cy5.5-HA)的构建及对对前哨淋巴结成像目的:本实验旨在开发Cy5.5-HA作为淋巴特异性成像剂,并评价其用于前哨淋巴结成像效果及可能的机制,为术中前哨淋巴结活检提供精准实时的术中指导方法:将透明质酸(Hyaluronica acid,HA)与近红外荧光分子Cy5.5结合,合成Cy5.5-HA作为淋巴特异性成像剂。使用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)和免疫荧光染色评估Cy5.5-HA对淋巴系统的亲和性。分别将分子量5K、10K、20KHA合成的Cy5.5-HA于小鼠足底注入,每10分钟行近红外荧光成像至3小时,观察其在淋巴系统内的迁移和前哨淋巴结的停留时间,筛选出最佳分子量。分别将相同分子量(10K)的Cy5.5-HA和Cy5.5-PEG于小鼠足底注入后,每10分钟行近红外荧光成像至2小时,比较两种探针在淋巴系统内的迁移和前哨淋巴结的停留时间。松节油诱导形成小鼠后腿局部炎症模型第5天,分别于炎症侧和对侧注入等量Cy5.5-HA,每10分钟行近红外荧光成像至2小时,对比两侧成像差别。结果:通过ELISA和免疫荧光染色表明,Cy5.5-HA能够结合到淋巴系统内标志物LYVE-1。在小鼠模型中,HA最适的成像分子量是10KDa,前哨淋巴结成像的时间窗是60分钟到180分钟。与对照10K Cy5.5-PEG在体内成像相比,具有更好的前哨淋巴结停留,表明Cy5.5-HA在前哨淋巴结内的积聚,是与其特异性结合相关,而不是单纯的与分子量大小相关。结论:Cy5.5-HA是一种有效的淋巴显像剂,能够在淋巴系统内特异性结合,积聚于前哨淋巴结。1 OK Cy5.5-HA在小鼠体内表现适宜的成像时间。第二部分肿瘤特异性探针(IRDye800-mAb)构建及对肿瘤组织成像目的:本实验旨在构建肿瘤抗体探针,评估探针成像肿瘤的敏感性,以用于术中鉴别淋巴结转移,部分的替代术中淋巴结病理检查。方法:将近红外染料IRDye800与与抗表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)抗体西妥昔单抗(Cetuximab)和抗人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)抗体曲妥单抗(trastuzumab)结合,合成IRDye800-Cetuximab 和 IRDye800-Trastuzumab 两种探针。在 BALB/c 裸鼠裸鼠肩部建立 UM-SCC-22B 皮下瘤模型后,静脉注射 IRDye800-Cetuximab(1nmol)后 0、1、4、8、16、24、48、96行近红外荧光成像,观察肿瘤可成像最佳时间。将UM-SCC-22B细胞使用IRDye800-Cetuximab(5umol/L,24小时)孵育后,分不同数量(1K,3K和10K)注入到BALB/c裸鼠皮下,立即行近红外荧光观察,确定最小可识别细胞数。将不同数量(1K,3K和10K)UM-SCC-22B,注射到BALB/c裸鼠皮下,24小时后静脉注射IRDye800-Cetuximab(1nmol),24小时后行近红外荧光成像,观察可成像最小细胞数。结果:我们构建了肿瘤抗体近红外探针(IRDye800-Cetuximab和IRDye800-Trastuzumab)。静脉注射IRdye800-Cetuximab成像皮下瘤模型,在静脉注入探针后4小时即可显现肿瘤组织,并在24小时到96小时维持在较高的平台期。为验证抗体探针的敏感性,我们通过皮下瘤模型成像,测定出IRdye800-Cetuximab检测UM-SCC-22B细胞的敏感性在1000个细胞级别,直径为微米级大小,敏感性较高。结论:我们可以认定肿瘤标志抗体探针具有较高的敏感性和较长的成像时间,因此具有用于术中成像转移淋巴结的潜力。第三部分双探针共同应用对于前哨淋巴结转移成像目的:本实验旨在结合淋巴显像剂和肿瘤靶向剂,构建一种术中定位前哨淋巴结并能同时区分前哨淋巴结内是否有肿瘤转移的成像方法,以提供精准实时的术中指导。方法:将Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab溶液同时置于近红外荧光成像,区分两种光谱。将带有Fluc+荧光素酶基因的UM-SCC-22B细胞和SKOV-3细胞,经小鼠足底注射,分别建立头颈癌和卵巢癌前哨淋巴结转移模型,每周行生物活体发光成像观察肿瘤生长和淋巴结转移情况。头颈癌淋巴结转移模型建立后6周后,静脉注射IRDye800-Cetuximab(0.5 nmol,100 uL)探针,肿瘤原位注射 Cy5.5-HA(0.2 nmol,10 uL),对(?)窝淋巴结成像,并行病理切片验证。卵巢癌淋巴结转移模型建立后7周后,静脉注射 IRDye800-Trastuzurmab(0.5nmol,100uL)探针,肿瘤原位注射 Cy5.5-HA(0.2 nmol,10 uL),对(?)窝淋巴结成像,并行病理切片验证。结果:近红外成像设备良好的区分了 Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab两种溶液光谱。经过一系列应用IRDye800标记的抗体和Cy5.5标记的HA对肿瘤转移模型小鼠成像,成功的区分出未转移淋巴结、部分转移淋巴结和肿瘤组织完全占据的淋巴结等三种转移状态的前哨淋巴结,并得到病理结果证实。结论:综合应用肿瘤靶向剂和淋巴显像剂两种探针成功地成像了前哨淋巴结,双探针荧光成像不仅定位了前哨淋巴结,也评估了前哨淋巴结转移情况。这种成像策具有提供准确且实时的术中成像导航的潜力。