【摘 要】
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S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)参与生物体内许多生化代谢反应。在生物体内,SAM是由L-蛋氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)经腺苷蛋氨酸合酶(S-adenosylmethionine synthetase,MAT,EC 2.5.1.6)催化合成。目前,SAM的生产方式有酶催化法和微生物发酵法,随着SAM在肝脏疾病、神经疾病以及关节炎治疗作用研究的不断深
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S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl-L-methionine,SAM)参与生物体内许多生化代谢反应。在生物体内,SAM是由L-蛋氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)经腺苷蛋氨酸合酶(S-adenosylmethionine synthetase,MAT,EC 2.5.1.6)催化合成。目前,SAM的生产方式有酶催化法和微生物发酵法,随着SAM在肝脏疾病、神经疾病以及关节炎治疗作用研究的不断深入,市场对于SAM的需求也日益增加。但是,目前的SAM生产方式存在着生产成本高、底物转化效率低、生产强度低等问题,限制着工业生产规模的扩大。随着分子生物学和基因工程技术的发展,通过代谢改造探索构建高产SAM工程菌株的策略成为打破生产瓶颈的关键,其中,通过提高胞内前体供给策略来强化SAM合成对于提高产量、降低生产成本具有重要意义。本研究首先筛选SAM生产及代谢改造的底盘细胞,进而探索可提高其前体L-Met和ATP供给的策略,并对其进行培养基优化,主要研究内容和研究结果如下:(1)为选择合适的底盘细胞,将酿酒酵母来源的MAT编码基因sam2分别在大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中过表达,结果显示在酿酒酵母中利用整合型质粒过表达sam2获得的工程菌株C2的SAM发酵评价最高。SAM产量达到623.98 mg·L-1,是出发菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK 2-1C的5.72倍,生产强度为25.99 mg·L-1·h-1。因此,本研究选择酿酒酵母为底盘细胞开展进一步的研究工作。(2)为探索通过提高前体L-Met供给来增强SAM合成的策略,探究了过表达编码蛋氨酸合酶的met6基因对前体L-Met的胞内含量的影响及SAM产量的变化情况,结果显示,C26的L-Met的最高积累量528.50 mg·L-1,是C2的1.33倍,C26的SAM产量为837.20 mg·L-1,生产强度为34.88 mg·L-1·h-1,与单独表达sam2的菌株相比分别提高了34.17%,34.20%;在此基础上,进一步比较了编码乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的met25和编码胱硫醚-γ-合酶的str2基因对L-Met供给和SAM生产的影响,确定了str2的过表达更有效地提高了L-Met和SAM的胞内积累量,相较于C26,C262的胞内L-Met的积累量提高了55%,SAM产量为1,070.82 mg·L-1,生产强度达到44.61 mg·L-1·h-1,分别提高了27.90%,27.89%。(3)为探索通过提高前体ATP供给来增强SAM合成的策略,探究了编码腺苷酸激酶的adk1基因对ATP的胞内含量及SAM产量的影响。结果表明,工程菌株C2621的胞内ATP含量达到50.04 mg·g-1,SAM产量达到1,185.82 mg·L-1,分别较C262提高了42.88%和10.73%。在此基础上,探究了编码透明颤菌血红蛋白VHb的vgb基因对胞内ATP及SAM积累量的影响,结果表明,C2621v的胞内ATP含量上升41.64%,达到70.88 mg·g-1,但生长速度明显放缓,且生物量降低10.03%,仅为OD600=12.73,SAM产量未见下降,SAM胞内含量上升。(4)为了提高工程菌株C2621v在摇瓶条件下的SAM产量,本文分别探究了发酵培养基中碳源的种类及浓度、氮源的种类及浓度、Mg SO4的浓度、柠檬酸钠的浓度。结果表明,当碳源为蔗糖,浓度为90 g·L-1,蛋白胨的浓度为30 g·L-1,酵母粉浓度为15g·L-1,Mg SO4浓度为1.5 g·L-1,不添加柠檬酸钠时,生物量达到最大OD600=23.19,SAM的产量达到最高1,980.20 mg·L-1,较优化前提高了71.70%,是出发菌株S.cerevisiae CEN.PK 2-1C的18.18倍。
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