一、研究背景近年来,肥胖已经被定义为一种全球性的流行性疾病。无论是在发达国家还是发展中国家,由于营养过剩或遗传因素导致的肥胖症都成为影响人们生活水平和身体健康的重要障碍2.3。肥胖不仅能够引起各种继发性疾病例如关节炎、胆结石、阻塞性睡眠窒息症、低通气综合征、不孕症等,而且还与一系列的慢性疾病例如高血压,二型糖尿病,心肌梗塞甚至某些癌症密切相关4。肥胖症是由多种因素引起的慢性代谢性疾病,特征是体内脂肪细胞的体积和细胞数增加,体脂占体重的百分比异常增高,并在某些局部过多沉积。白色脂肪组织是含量最多的脂肪组织,其最主要的功能是储存机体摄入过量的能量与脂类,为人和动物保暖和保护内脏抵抗外界冲击。近年来研究表明,白色脂肪组织通过分泌激素等因子5,调控诸如葡萄糖的代谢,食欲,免疫应答,血管生成,血压和生殖功能等等生理和病理过程。研究脂肪细胞的代谢过程,不仅有助于揭示脂肪组织如何调控葡萄糖与游离脂肪酸的代谢过程,更能为肥胖相关疾病的诊断与治疗提供新的策略与想法。De novo lipogenesis(DNL)脂质新生(脂肪的从头合成)是把过剩的碳水化合物转化合成游离脂肪酸的过程。这些游离脂肪酸可以和甘油一起被转化为甘油三酯储存起来。在通常情况下,脂质新生(DNL)这个过程主要发生在肝脏和脂肪组织6.7。然而有研究表明,脂质新生过程产生的游离脂肪酸对于血清中的游离脂肪酸贡献并不大,合成的脂肪酸会被储存起来,血清游离脂肪酸大多来自食物摄入8。另一些研究显示,在高碳水化合物或高脂肪饮食的情况下,肝脏的脂质新生产生的游离脂肪酸会大量进入血液形成血脂7,最终被肌肉组织利用或被白色脂肪组织储存起来。而在体外培养脂肪前体细胞3T3-L1向成熟的脂肪细胞分化的过程中,甘油三酯的积累则主要是靠摄入葡萄糖进行脂质新生DNL过程。在脂质新生过程中,碳原子从碳水化合物流向游离脂肪酸的过程中需要一系列的相应的酶进行催化,其中包括ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACLY)、乙酰辅酶a竣化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN),硬脂酰CoA去饱和酶-1(Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1)等9。脂肪酸合成酶(FASN)是关键的速率限制酶,它将丙二酰辅酶A和乙酰辅酶A转化为长链脂肪酸,它的表达受到日常饮食和胰岛素调节,调控其表达的转录因子有SREBP1和ChREBP。在哺乳动物细胞中,胆固醇和其他膜脂等脂质的合成受固醇调节元件结合蛋白 sterol regulatory element binding proteins(SREBPs)调节 10-12。SREBPs 可分为三种亚型,分别为SREBP-1a,SREBP-1c and SREBP-2。SREBP-1a可以激活胆固醇和脂肪酸的两种生物合成途径,而主要存在于肝脏的SREBP-2亚型则相对特异促进胆固醇的生物合成。SREBP-1c除了可以调节脂肪酸的合成还能影响脂肪细胞的分化13,是脂肪组织脂质合成的关键转录因子11。SREBPs在内质网上合成并经由囊泡转运到高尔基体,最后被剪切成熟,形成mSREBPs(mature SREBPs),后者进入核内,调节脂质合成等相关基因的表达。在内质网上,SREBPs 的伴侣蛋白 SREBP cleavage-activating protein(SCAP)与 SREBPs 结合形成SCAP-SREBPs复合物14,并协助其出芽形成囊泡,转运到高尔基复合体,而这一过程受到细胞质中固醇浓度的调节15。在胞内低固醇浓度时,SCAP-SREBP转位至高尔基复合体,SR Figure 2.Generation and Validation of raptor Knockout(125kDa)在 SCAP 的协助下被两个水解酶 SlP(sitel protease)和S2P(site 2 protease)剪切下SREBPs的NH2-末端锌指结构16,形成成熟SREBPs(mSREBPs)(68kDa)进入细胞核,作为转录因子激活脂肪酸合成相关酶的表达(如FANS,ACC,SCD1等);而在胞内高固醇浓度时,SCAP与内质网驻留蛋白INSIG1/2结合,SCAP-SREBP复合物则不能转位至高尔基复合体,因而不能被水解酶水解和入核调控脂肪酸合成酶的表达11。有研究表明,AMPK能够通过磷酸化SREBP-1c的372位点从而抑制蛋白水解作用从而抑制其成熟入核。PKDs属于一类新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由于其激酶结构域与钙/钙调蛋白调节性激酶(CAMK)家族高度同源而并不与PKC家族同源,故现已将其归为CAMK家族激酶。目前已鉴定出三种PKD亚型(PKD1,2,3)17。根据不同的细胞类型和外源性刺激,PKD可以定位于细胞质、细胞核、高尔基复合体、细胞质膜等等不同的区域。有研究表明,在上皮来源的细胞中,所有三种PKD的亚型主要定位于反式高尔基体膜上18。PKD1已经被证明其在二酰基甘油(DAG)的刺激下通过氨基末端结合在高尔基复合体膜上19,主要介导高尔基体的囊泡转运。当PKD被募集到高尔基复合体后,蛋白激酶Cη(PKCη)就能通过磷酸化PKD的活化环(activation loop)激活PKD。而蛋白激酶Cη(PKCη)的激活则依赖于G蛋白三聚体Gβ1γ2和Gβ3γ218。近年来,PKD1在脂肪细胞中的作用日益受到人们的关注。体外细胞研究显示,PKD1的表达与脂肪细胞中脂联素(adiponectin)和瘦素(leptin)的合成和分泌密切相关,下调PKD1的表达可以抑制瘦素的分泌20。而激活的PKD1能通过转录因子AP-2β调节脂肪细胞因子(adipocytokine)的表达,例如能够上调 MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)和IL-6(Interleukin-6),下调脂联素的表达21。上述体外研究提示,PKD1有可能通过分泌激素参与脂肪组织自身代谢的调控,但其在脂肪组织内的功能作用研究较少及其相关调控机理尚不清楚。在BIOGPS的数据库中,我们发现PKD1在小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织中表达远远高于其他组织,在白色脂肪中大约为平均水平的10倍而棕色脂肪则是平均水平的20倍。但是,在脂肪前体细胞3T3-L1中,PKD1却几乎没有表达。那么,脂肪组织大量的表达PKD1除了能够调控脂肪组织分泌相关激素以外,还能起到什么作用仍然是不清楚的。二、研究目的本研究利用脂肪组织特异性敲除PKD1小鼠模型,结合RNA-sequencing转录组分析以及体外细胞实验,探讨了 PKD1调节脂肪细胞中的脂质新生功能及其作用机理,该研究不仅有助于深入了解PKD1在脂肪组织中的功能作用,而且为进一步以脂肪堆积和肥胖为靶点的相关疾病的治疗提供新的思路。三、研究方法首先通过构建脂肪特异性敲除PKD 1的动物模型确认PKD 1缺失对于脂肪细胞的影响,找到相关的表型特征。对条件性敲除小鼠的脂肪组织进行RNA-sequencing,并进行GO分析,得到相应的有显著意义变化的基因找出变化基因的相关性。对筛选出的基因进行实时定量PCR和免疫印迹WB,免疫荧光染色,免疫共沉淀,免疫组织化学等方法证实,体外细胞实验通过过表达和干扰PKD1观察探究脂肪细胞成脂功能的变化及机理。四、研究结果1.脂肪组织特异性敲除PKD1使小鼠能够抵抗高脂饮食引起的肥胖我们利用loxp-cre系统特异性敲除C57BL6背景小鼠的脂肪组织的PKD1,成功得到基因敲除鼠后进行了普通饮食和高脂饮食的实验,结果表明,脂肪特异性敲除PKD1小鼠对于高脂饮食诱导不敏感,相对于对照组小鼠体重降低,并且有统计学差异(p<0.01,n=7)。将实验组(PKD1ad-/-)与对照组(PKD1fl/fl)小鼠各个内脏器官称量并没有差异,而各部位白色脂肪组织以及体脂率PKD1ad-/-则明显低于PKD1fl/fl,有显著统计学差异(p<0.01,n=7),实验组小鼠脂肪含量明显低于对照组。将实验组(PKD1ad-/-)与对照组(PKD1fl/fl)小鼠的白色脂肪做石蜡切片并进行苏木精-伊红染色发现,实验组脂肪细胞体积小于对照组细胞体积,通过image J软件测量细胞内空泡面积,得到平均单个细胞空泡面积,高脂喂食条件系实验组细胞空泡面积小于对照组,具有统计学差异(p<0.01,n=4)。2.RNA-sequencing显示脂肪组织特异性敲除PKD1可降低脂肪从头合成途径以及脂质代谢相关基因的表达将实验组(PKD1ad-/-)与对照组(PKD1fl/fl)小鼠白色脂肪取出进行转录组测序。测序结果表明,小鼠白色脂肪组织中,实验组的脂肪酸合成酶(FASN),ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)、乙酰辅酶a羧化酶(ACC)都有显著意义下调。而涉及外源性游离脂肪酸吸收的LPL,CD36则没有显著意义变化。提示PKD1adipose-/-小鼠脂肪组织重量减轻可能是由于脂肪细胞内脂肪酸从头合成途径(DNL)降低所致。3.Real time RT-PCR和Western blot证实脂肪组织特异性敲除PKD1降低脂肪从头合成途径相关限速酶的mRNA及蛋白水平的表达通过Real time RT-PCR和Western blot检测显示脂肪组织以及体外分化3T3-L1脂肪细胞敲除PKD1会下调脂质新生途径的相关限速酶例如脂肪酸合成酶(FASN),ATP-柠檬酸裂解酶(ACLY)、乙酰辅酶a羧化酶(ACC)mRNA和蛋白水平的表达。上述结果提示我们,PKD1是通过脂质新生途径(DNL)影响脂肪组织的脂质合成的。4.PKD1通过调控SREBP-1C的剪切入核促进脂质合成已有研究表明,SREBP1作为调控脂肪从头合成途径的转录调控因子,其Ser372位点可被AMPK磷酸化,SREBP1前体的剪切、成熟及入核受到抑制22。通过Western blot检测显示在脂肪组织中特异性敲除PKD1会导致SREBP-1c的Ser372位点的磷酸化水平升高,而SREBP-1c的成熟体mSREBP-1c(mature SREBP-1c,68kDa)的总含量则相对减少。提取核蛋白进行Western blot检测也显示核内mSREBP-1c(成熟体)明显减少。在体外,对分化的3T3-L1脂肪细胞干扰PKD1表达能够升高p-372-SREBP-1c位点的磷酸化水平,降低SREBP-1c(成熟体)的水平。提示在正常情况下,PKD1可能通过下调SREBP-1c的ser372位点的磷酸化,解除AMPK的抑制作用,从而促进SREBP-1c的剪切成熟和入核。5.PKD1能够与SREBP1-C以及SCAP相互作用免疫共沉淀实验证明PKD1能与SREBP1-C以及SCAP相互作用。生物信息分析初步显示小鼠SREBP1的蛋白序列中并没有保守的PKD1的识别位点,但我们在SREBPs的伴侣蛋白SCAP的蛋白序列上找到了 PKD 1的保守识别位点Ser628。提示我们PKD1是通过与SCAP的结合促进SREBP1的去磷酸化剪切成熟过程。五、结论本研究结果表明,在小鼠脂肪组织中PKD1通过与SCAP和SREBP-1c的相互结合促进SREBP-1c的NH2末端的剪切形成活化型并进入核内,促进脂质新生相关基因FASN,ACAC的转录翻译。这一研究结果对于脂肪组织脂质堆积的影响因素有了新的解释,也可为肥胖症治疗提供新的方向。